固相萃取凈化-高效液相色譜法測定食品中α-細辛醚和β-細辛醚殘留量

彭 芳，雷美康，許菲菲，柴明青，祝子銅，徐倩倩，李 東，余 琪

（1.衢州出入境檢驗檢疫局，浙江 衢州 324002；2.義烏出入境檢驗檢疫局，浙江 義烏 322000）

固相萃取凈化-高效液相色譜法測定食品中α-細辛醚和β-細辛醚殘留量

彭 芳1，雷美康1，許菲菲2，柴明青2，祝子銅1，徐倩倩1，李 東1，余 琪1

（1.衢州出入境檢驗檢疫局，浙江 衢州 324002；2.義烏出入境檢驗檢疫局，浙江 義烏 322000）

建立用于測定乳粉、綠豆糕、豬肉、熏魚肉、調味粉中白菖蒲油主要成分α-細辛醚和β-細辛醚含量的固相萃取-高效液相色譜分 析方法。選擇乙腈提取樣品中的細辛醚，提取液經硅膠固相萃取小柱凈化，采用配備熒光檢測器的高效液相色譜儀進行分離測定，外標 法定量。乳粉、綠豆糕、豬肉、熏魚肉、調味粉中α-細辛醚和β-細辛醚的方法定量限均為0.01 m g/kg，在0.01～0.50 mg/kg的添加水平范圍內，α-細辛醚的 平均回收率在78.2%～99.4%之間，β-細辛醚的平均回收率在80.8%～10 5.6%之間，相對標準偏差為1.6%～10.3%。該方法能夠滿足食品中細辛醚的痕量檢測要求。

α-細辛醚；β-細辛醚；食品；固相萃取；高效液相色譜法

菖蒲作為藥材在印度和埃及至少已有2 500 a的歷史。我國《神農本草經》列為上品，使用也有2 000 a的歷史。菖蒲作為一種補藥和興奮劑聞名已久，在歐洲和美國也廣泛使用。它能增進食欲，改善消化功能而用于食物的烹調。其味苦、辛，有特殊的芳香氣味，可用于肉類、禽類的鹵制、醬制加工品。既有開胃、減輕腸氣、緩解消化不良的作用，又有去腥去臭和增香增味的作用［1］。白菖蒲油是國際市場上重要的精品油之一，由天南星科植物白菖蒲的根莖經水蒸氣蒸餾制得，為淡黃至淡褐色黏稠狀揮發性精油，呈奶油似香氣，略帶苦辣味。歐洲、美洲的白菖蒲油在食品中，同小豆蔻油、獨活油、生姜油等用于各種烹飪中。在含酒精飲料中可令飲料溫暖辛香［1］。白菖蒲油的主要活性成分為α-細辛醚（又稱α-細辛腦）和β-細辛醚（又稱β-細辛腦）。美國食品藥品監督管理局在1971年宣稱白菖蒲油中的細辛醚具有致癌性，歐美等國家也因為白菖蒲油可能會對人體帶來潛在的健康危害，對細辛醚的人體攝入量作出了嚴格限定。由消費者健康保護協會歐洲委員會食品科學委員會發布，2001年12月12日實施的《食品科學委員會對調味劑和其它食品配料中含β-細辛醚的評價》中明確提出β-細辛醚人最大日可攝取量為115 μg［2］。

目前α-細辛醚和β-細辛醚的檢測方法主要集中在氣相色譜法［3-4］、高效液相色譜法［5-18］和氣相色譜-質譜法［19-20］，近年也發展起來液相色譜-質譜法［21-23］，但僅限于 測定藥材、血漿及煙草中其含量，針對食品中細辛醚含量的檢測目前尚未見報道。

本實驗采用固相萃取-高效液相色譜法研究了5 種食品中α-細辛醚 和β-細辛醚殘留的定性和定量分析方法，用乙腈提取樣品中的細辛醚，離心，上清液減壓蒸干后，正己烷溶解殘渣，硅膠固相萃取小柱凈化，采用配備熒光檢測器的高效液相色譜進行分離測定，外標法定量。方法的靈敏度和準確性能夠滿足日常對食品中白菖蒲油有效成分α-細辛醚和β-細辛醚含量測定的需求。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬肉、熏魚肉、綠豆糕、調料粉、乳粉來源于當地超市。

乙酸乙酯、乙腈、正己烷、甲醇（均為色譜純）德國Meker公司；α-細辛醚（純度≥98%） 中國食品藥品檢定研究院；β-細辛醚（純度≥70%） 德國DR公司。

1.2儀器與設備

1200高效液相色譜儀（配熒光檢測器、Silica硅膠固相萃取小柱（1 g，6 mL，使用前依次用5 mL乙酸乙酯、5 mL正己烷活化，保持柱體濕潤）） 美國 Agilent公司；ROTAVAPOR R-210真 空旋轉蒸發儀（配1 00 mL雞心瓶） 瑞士Büchi公司；Biofuge Primor離心機（不低于4 000 r/min） 美國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

標準儲備液的配制：準確稱取適量的細辛醚標準品，用甲醇溶解配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，該溶液配制于棕色容量瓶中，-18 ℃以下避光保存；標準中間溶液的配制：用甲醇將標準儲備液逐級稀釋至1.0 μg/mL。該溶液配制于棕色容量瓶 中，-18 ℃以下避光保存。標準工作溶液的配制：根據需要，臨用時吸取一定量的標準中間溶液，用甲醇配制成適當質量濃度的混合標準工作溶液，在0～4 ℃避光冷藏保存；水為超純水。

1.3.2提取

準確稱取5 g試樣（精確到0.01 g）置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，以4 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至雞心瓶中，再用20 mL乙腈重復上述提取步驟，合并提取液。在45 ℃減壓旋轉蒸發濃縮至干，加入3 mL正己烷，渦旋振蕩溶解，待凈化。

1.3.3凈化

將待凈 化溶液轉移至 固相萃取柱中，用3 mL正己烷沖洗雞心瓶，洗液上柱淋洗，棄去淋洗液，用8 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液至上述雞心瓶中，在 45 ℃減壓旋轉蒸發濃縮至干，用2 mL甲醇溶解殘渣，溶解液過0.45 μm有機系微孔濾膜過濾，待測。

1.3.4色 譜分析條件

Ag ilent XCB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；激發波長：265 nm；發射波長：365 nm；柱溫30 ℃；流動相：甲醇-水（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2　結果與分析

2.1提取溶劑的選擇

α-細辛醚和β-細辛醚可溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯。本實驗采用甲醇、乙腈和乙酸乙酯提取，結果表明三者均有滿意的回收率，但經過實驗發現乙酸乙酯、甲醇提取的雜質較乙腈多，特別是油狀物的雜質，為下一步凈化帶來困難，因此本實驗選用乙腈作為提取溶劑。

2.2凈化方法的選擇

固相萃取凈化方法是復雜基質中痕量檢測常用的凈化方法。本實驗根據α-細辛醚和β-細辛醚的極性大小等理化性質，研究了C18、HLB、弗羅里硅土和硅膠4 種固相萃取方法的凈化效果，在上樣溶劑的選擇上，分別比較乙腈、甲醇、甲醇-水混合體系、乙酸乙酯和正己烷；在洗脫溶劑的選擇上，分別比較了乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙酸乙酯-正己烷混合體系的回收率和凈化效果。經過實驗對比，選擇硅膠固相萃取小柱凈化，正己烷作為上樣液，乙酸乙酯作為洗脫液的固相萃取凈化方法，去除雜質干擾效果好，簡便快捷，具有良好的色譜保留，回收率穩定。

2.3色譜條件的優化

對α-細辛醚和β-細辛醚標準溶液檢測波長進行掃描，固定激發波長257 nm，對發射波長進行掃描，得到最大發射波長為365 nm；固定發射波長為365 nm，對激發波長進行掃描得到最大激發波長為265 nm。因此確定激發波長為265 nm，發射波長為365 nm。實驗采用Agilent XCB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，甲醇-水，乙腈-水作為流動相比對分離效果，結果表明，2 種色譜柱和2 種流動相都能得到滿意的效果。考慮到成本，本實驗選擇Agilent XCB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，甲醇-水（60∶40，V/V）作為流動相，30 ℃作為參考色譜條件。在上述色譜條件下，α-細辛醚和β-細辛醚的保留時間分別約為14 min和12 min，見圖1。

圖 11 α--細辛醚和β-細辛醚標準品的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of α-asarone and β-asarone standards

2.4標準曲線、線性關系及方法定量限

用甲醇配成α-細辛醚和β-細辛醚質量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 mg/L和2.5 mg/L的混合標準工作液。儀器響應峰面積Y對應細辛醚質量濃度X進行線性回歸，2 種細辛醚的線性關系良好，見表1。以實際檢測時的信噪比（RSN＞10）確定方法定量限，豬肉、熏魚肉、綠豆糕、調料粉、乳粉中的α-細辛醚和β-細辛醚含量的方法定量限均為0.01 mg/kg。

表1　-細辛醚和-細辛醚的回歸方程、相關系數和線性范圍Table 1 Regression equations with correlation coeffifi cients and linear ranges for -asarone and -asarone

2.5實驗室內回收率和精密度

表2　空白樣品添加細辛醚的回收率及精密度（n=6）Table 2 Recoveries and precision of asarones in blank samples （n= 6）

采用標準添加法，在空白樣品中添加3 個水平的細辛醚標準工作溶液，每個添加水平平行測定6次，測定結果見表2。結果表明，在0.01～0.50 mg/kg的添加水平范圍內，α-細辛醚的平均回收率在78.2%～99.4%之間，β-細辛醚的平均回收率在80.8%～105.6%之間，相對標準偏差為1.6%～10.3%，滿足日常檢測需要。

3　結 論

本實驗建立了用于檢測乳粉、綠豆糕、豬肉、熏魚肉、調味粉等食品中白菖蒲油主要成分α-細辛醚和β-細辛醚含量的固相萃取-高效液相色譜分析方法。選擇乙腈提取樣品中的細辛醚，提取液經硅膠固相萃取小柱凈化，采用配備熒光檢測器的高效液相色譜儀進行分離測定，外標法定量。該方法具有操作簡便、靈敏、準確的優點，可用于乳粉、綠豆糕、豬肉、熏魚肉、調味粉等中的α-細辛醚和β-細辛醚殘留的定性和定量分析。

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Determination of α-asarone and β-asarone Residues in Foods by Solid Phases Extraction-Liquid Chromatography

PENG Fang1， LEI Meikang1， XU Feifei2， CHAI Mingqing2， ZHU Zitong1， XU Qianqian1， LI Dong1， YU Qi1
（1. Quzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ， Quzhou 324002， China；2. Yiwu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Yiwu 322000， China）

A sens itive and selective method was developed for the determination of residues of α-asarone a nd β-asarone as the main components of calamus oil in milk powder， mung bean cake， pork， smoked fi sh， and seasoning powder. The residues of α-asarone and β-asarone in the test samples were extracted with acetonitrile. The extract was cleaned up with a silica gel solid phase extraction column， analyzed by high performance liquid chromat ography （HPLC） equipped with a fl uorescence detector， and quantifi ed by external standard method. Milk powder， green bean cake， pork， smoked fi sh and seasoning powder were chosen as the representative samples. The limit of quantifi cation （LOQ） （RSN＞ 10） was 0.01 mg/kg in al l these sample s. The average recoveries of α-asarone and β-asarone at three spiked levels （0.01， 0.05 and 0.50 mg/kg）ranged from 78.2% to 99.4% and 80.8% to 105.6%， respectively， with rela tive st andard deviations （RSDs） between 1.6% and 10.3%. The method can meet the analytical requirements for trac e asarones in foods.

α-asarone； β-asarone； food； solid phase extraction （SPE）； high performance liquid chromatography （HPLC）

O657.63

A

1002-6630（2015）18-0190-03

10.7506/spkx1002-6630-201518035

2014-10-22

國家出入境檢驗檢疫行業標準制修訂項目（2009B527）

彭芳（1982—），女，工程師，碩士，研究方向為食品檢驗。E-mail：vivian_pf@126.com