高效毛細(xì)管電泳法對(duì)5 個(gè)產(chǎn)地苦蕎中黃酮類化合物的檢測(cè)

郭芳芳，馮 鋒，，*，白云峰，劉荔貞，陳澤忠，李 蓉，周 高

（1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；2.大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西 大同 037009）

高效毛細(xì)管電泳法對(duì)5 個(gè)產(chǎn)地苦蕎中黃酮類化合物的檢測(cè)

郭芳芳1，馮 鋒1，2，*，白云峰2，劉荔貞2，陳澤忠2，李 蓉2，周 高2

（1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；2.大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西 大同 037009）

采用高效毛細(xì)管電泳法，分別對(duì)5 個(gè)不同產(chǎn)地苦蕎中黃酮類化合物進(jìn)行檢測(cè)。電泳條件：10 mmol/L Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液，pH 9.3，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm，分離電壓25 kV。在該條件下，表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素4 種黃酮類化合物在7 min內(nèi)得到分離，線性范圍分別為0.03～0.54、0.05～0.97、0.03～0.63、0.04～0.90 mg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.992 3～0.998 7，最低檢出限分別為5.33×10-6、1.80×10-5、2.51×10-5、1.24×10-5mg/mL（RSN=3），平均回收率在95.5%～104.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于3.66%。結(jié)果表明：該方法準(zhǔn)確可靠，可用于苦蕎中黃酮類化合物的檢測(cè)。

高效毛細(xì)管電泳；黃酮類化合物；苦蕎

苦蕎，又名韃靼蕎麥，為一年生蓼科類草本植物，是國(guó)際糧農(nóng)組織公認(rèn)的糧藥的同源食物之一，苦蕎中含有大量的化學(xué)活性物質(zhì)，包括黃酮類化合物［1-2］、維生素［3］、蛋白質(zhì)［4］等。相關(guān)研究表明苦蕎的大多數(shù)藥理作用都與苦蕎中酚類化合物有關(guān)，而苦蕎中最主要的酚類化合物是黃酮類物質(zhì)［5］。許多研究表明黃酮類化合物具有抗氧化［6-8］、抗腫瘤［9］、抗敏［10］、抗菌抗病毒［11］、降血糖［12］、降血脂［10-12］、降血 壓等作用［13］。因此建立一種對(duì)苦蕎中的黃酮類化合物進(jìn)行檢測(cè)的方法非常重要。

目前對(duì)苦蕎中黃酮類化合物的檢測(cè)方法主要有分光光度法［4，14-16］、薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）法［17］、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［18-22］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［23］以及毛細(xì)管電泳法［24］等。分光光度法選擇性較差，TLC法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度低，HPLC法試劑消耗量大，所需成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)。而毛細(xì)管電泳法具有試劑消耗量小、柱效高、分析速度快、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于食品和藥品活性物質(zhì)的檢測(cè)中。到目前為止，毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)于不同產(chǎn)地苦蕎中黃酮類化合物的分析應(yīng)用尚未有見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳法對(duì)5 個(gè)不同產(chǎn)地的苦蕎中表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素4 種黃酮類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，為苦蕎的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

四川大涼山、山西廣靈、山東沂蒙、云南昆明、山西左云的苦蕎 市購(gòu)；氫氧化鈉（分析純） 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；硼砂、硼酸（均為分析純） 天津化學(xué)試劑三廠；黃酮類化合物（表兒茶素、蘆丁、山奈酚、槲皮素） 美國(guó)阿拉丁公司；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2儀器與設(shè)備

P/ACETMMDQ高效毛細(xì)管電泳儀（配有紫外檢測(cè)器以及32 Karat軟件） 美國(guó)Beckman公司；內(nèi)徑75 μm未涂層石英毛細(xì)管 邯鄲鑫諾光纖色譜有限公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AP250D分析天平 美國(guó)Ohaus公司；TDL-16B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PSH-2C型精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；0.22 μm一次性針孔過(guò)濾器；Lambda35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)PerkinEimer公司。

1.3方法

1.3.1溶液配制

分別稱量10 mg表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素于4 個(gè)10 mL容量瓶中，用二次蒸餾水溶解后定容成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。配制10 mmol/L硼砂（Na2B4O7）溶液，用10 mmol/L硼酸（H3BO3）溶液調(diào)至pH值為9.3。

1.3.2樣品處理

采用超聲法［25］對(duì)苦蕎中黃酮類化合物進(jìn)行測(cè)定。稱取適量苦蕎，在真空干燥器中烘干，后將其研成粉末，精密稱取5 g于50 mL錐形瓶中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)75%甲醇溶液并封口，超聲提取30 min，超聲前后用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液將不足量補(bǔ)足，轉(zhuǎn)移至離心管中，以6 000 r/min離心10 min，取上層清液，用0.22 μm一次性針孔過(guò)濾器過(guò)濾2 次，放置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3操作條件

對(duì)新毛細(xì)管進(jìn)行活化，在20 psi條件下，用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸餾水和緩沖溶液各沖洗30 min；2 次進(jìn)樣間分別用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸餾水和緩沖溶液沖洗5 min。檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm；分離電壓25 kV；進(jìn)樣時(shí)間5 s；緩沖溶液：15 mmol/L Na2B4O7-H3BO3，pH 9.3。

2　結(jié)果與分析

2.1電泳分離條件的確定

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用甲醇配制一定質(zhì)量濃度的表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇做空白，在波長(zhǎng)200～450 nm范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行紫外掃描，確定5 種色素在波長(zhǎng)218 nm處均有較大吸收，故將218 nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2緩沖溶液濃度和pH值的選擇

考察了Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液在不同濃度（10、20、30、40、50 mmol/L）時(shí)，4 種黃酮類化合物的分離情況。隨著緩沖溶液濃度增大，電流不斷增大，同時(shí)產(chǎn)生較多焦耳熱，基線響應(yīng)信號(hào)值增加，4 種黃酮類化合物不能完全出峰。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇10 mmol/L Na2B4O7-H3BO3為最佳緩沖溶液濃度。

考察pH值分別在9.1、9.2、9.3、9.4時(shí)對(duì)4 種黃酮類化合物分離的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)pH值為9.1時(shí)，表兒茶素和蘆丁未能完全分離；隨著pH值的增大，4 種分析物分離度變大，pH值為9.3時(shí)，分離完全；當(dāng)pH值為9.4時(shí)，蘆丁和山奈酚兩峰部分重合，分離不完全，因此實(shí)驗(yàn)中選擇9.3為最佳pH值。

圖1　pH值對(duì)分析物分離的影響Fig.1 Effect of running buffer pH on the separation of four analytes

2.1.3分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間的選擇

提高分離電壓，可以縮短分析時(shí)間，提高分離效率，但電壓過(guò)高，體系產(chǎn)生的焦耳熱也隨之增加，有可能出現(xiàn)基線不穩(wěn)，進(jìn)而影響分離效果。考察15、20、25、30 kV時(shí)，4 種黃酮類化合物的分離情況，結(jié)果如圖2所示。分離電壓在15 kV時(shí)，分析時(shí)間長(zhǎng)，山奈酚和槲皮素峰形差；分離電壓為20 kV和25 kV時(shí)，化合物可以完全分離，但在分離電壓為25 kV條件下，分析時(shí)間短；分離電壓為30 kV時(shí)，表兒茶素和蘆丁兩峰分離不是很完全。綜合考慮，選擇25 kV作為最佳分離電壓。

圖2　分離電壓對(duì)分析物分離的影響Fig.2 Effect of applied voltage on the separation of four analytes

在最佳電泳條件下，考察進(jìn)樣時(shí)間為3、4、5、6、7 s時(shí)4 種黃酮類化合物的的分離情況，結(jié)果如圖3所示。進(jìn)樣時(shí)間小于5 s時(shí)，進(jìn)樣量少，峰面積較小，但是當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間大于5 s時(shí)，峰面積增大，峰形展寬，峰形變差。綜合考慮，選擇5 s作為最佳進(jìn)樣時(shí)間。

圖3　進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分析物分離的影響Fig.3 Effect of injection time on the separation of four analytes

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限測(cè)定結(jié)果

用甲醇做溶劑，配制4 種黃酮化合物的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.03～0.97 mg/mL），在最佳電泳條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，得出各組分的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍和各物質(zhì)的檢出限（RSN=3），結(jié)果如表1所示。

表1　4 種黃酮化合物的線性方程及檢出限Table 1 Standard curves for determining four fl avonoids by HPCE and their limits of detection

2.3精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)考察4 種黃酮類物質(zhì)遷移時(shí)間以及峰面積的日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relation standard deviation，RSD），對(duì)方法的精密度進(jìn)行評(píng)估。4 種標(biāo)樣各取50 mL混合均勻，在最優(yōu)電泳條件下日內(nèi)、日間連續(xù)進(jìn)樣3 次，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算4 種黃酮類物質(zhì)遷移時(shí)間和峰面積的RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。日內(nèi)精密度RSD不大于1.88%，日間精密度RSD不大于3.66%，表明該方法精密度良好。

表2　精密度實(shí)驗(yàn)Table 2 Results of precision experiments

2.4實(shí)際樣品的測(cè)定

圖4　實(shí)際樣品的測(cè)定Fig.4 Chromatograms of real samples

按照1.3.2節(jié)方法對(duì)苦蕎樣品進(jìn)行處理，在最佳電泳條件下對(duì)樣品進(jìn)行分析，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法來(lái)確定樣品中是否含有被檢測(cè)的黃酮類物質(zhì)，結(jié)果如圖4所示。在實(shí)際樣品中分別添加一種黃酮標(biāo)準(zhǔn)樣品后，只有相對(duì)應(yīng)的電泳峰明顯升高且沒(méi)有引起新的電泳峰出現(xiàn)，證明實(shí)際樣品中有4 種被測(cè)黃酮類化合物的存在。

表3　5 種樣品的分析結(jié)果（n=3）Table 3 Assay results for flfl avonoids in fifi ve samples （n= 3）

按照1.3.2節(jié)的方法對(duì)苦蕎樣品進(jìn)行處理，提取液經(jīng)微孔膜過(guò)濾2 次后連續(xù)進(jìn)樣3 次，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果如表3所示。不同產(chǎn)地的苦蕎中，4 種被測(cè)黃酮類化合物中蘆丁含量均為最高。其中四川大涼山苦蕎中山奈酚和槲皮素含量均高于其他產(chǎn)地苦蕎。山西廣靈苦蕎中表兒茶素含量最高。被測(cè)4 種黃酮化合物總量從大到小分別為四川大涼山＞山西廣靈＞山東沂蒙＞云南昆明＞山西左云。

2.5回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在最佳電泳條件下進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，通過(guò)向苦蕎樣品提取液中加入一定量（3 個(gè)水平）的黃酮類化合物，來(lái)測(cè)定回收率，結(jié)果如表4所示，回收率范圍在95.5%～104.7%之間，RSD在1.57%～4.48%之間，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表4　回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 Results of recovery experiments

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用高效毛細(xì)管電泳法，對(duì)5 個(gè)不同產(chǎn)地苦蕎中黃酮類化合物進(jìn)行測(cè)定，在最佳電泳條件下（檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm，分離電壓25 kV，15 mmol/L Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液，pH 9.3），表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素4 種黃酮類化合物在7 min內(nèi)得到分離，線性范圍分別為0.03～0.54、0.05～0.97、0.03～0.63、0.04～0.90 mg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.992 3～0.998 7，最低檢出限（RSN=3）分別為5.33×10-6、1.80×10-5、2.51×10-5、1.24×10-5mg/mL，平均回收率為95.5%～104.7%，RSD不大于3.66%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠，適用于苦蕎中黃酮類化合物的分析。

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Determination of Flavonoids in Buckwheat from Five Different Growing Areas by High Performance Capillary Electrophoresis

GUO Fangfang1， FENG Feng1，2，*， BAI Yunfeng2， LIU Lizhen2， CHEN Zezhong2， LI Rong2， ZHOU Gao2
（1. College of Chemistry and Chemical Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；2. College of Chemical and Environmental Engineering， Datong University， Datong 037009， China）

An effi cient high performance capillary electrophoresis （CE） method has been successfully developed for the determination of flavonoids in buckwheat. The running buffer contained 10 mmol/L Na2B4O7-NaH2PO4， at pH 9.3， the detection wavelength was set at 218 nm and a voltage of 25 kV was applied. Under these conditions， four fl avonoids， i.e.，picatechin， rutin， kaempferd and quercetin， could be fully separated from each other within seven minutes. The linear ranges were 0.03 to 0.54， 0.05 to 0.97， 0.03 to 0.63， and 0.04 to 0.90 mg/mL， respectively， with correlation coeffi cients between 0.992 3 and 0.998 7 and the limits of detection （LOD） were 5.33 × 10-6， 1.80 × 10-5， 2.51 × 10-5， and 1.24 × 10-5mg/mL，respectively （RSN= 3）. The average recoveries were between 95.5% and 104.7%， with a relative standard deviation （RSD）less than 3.66%. This method is convenient to operate， accurate， effi cient and suitable for the simultaneous detection of fl avonoids in buckwheat.

high performance capillary electrophoresis； fl avonoids； buckwheat

O611.5

A

1002-6630（2015）18-0085-04

10.7506/spkx1002-6630-201518015

2015-01-25

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21375083）

郭芳芳（1989—），女，碩士研究生，主要從事毛細(xì)管電泳研究。E-mail：13546046121@163.com

馮鋒（1964—），男，教授，博士，主要從事光分析化學(xué)研究。E-mail：feng-feng64@263.net