腦卒中細胞治療中誘導多功能干細胞的應用潛力

翁南川 詹仁雅

[摘要] 目的 誘導多功能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs）， 方法 主要是借助于誘導已分化的一種成熟體細胞異位，對某一個或者某一些基因進行表達，進而重新整編得到的一種多功能干細胞。結果 誘導多功能干細胞和胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）有著一定的相似度，不僅僅存在高度增值性，同時也存在多向分化潛能，可以分化成為神經元。結論 IPSCs具有無道德倫理障礙，無免疫排斥，取材方式簡單、無創等優點，為腦卒中的細胞治療提供了新的希望。現就近年來與iPSCs治療腦卒中相關的研究作一綜述。

[關鍵詞] 腦卒中；誘導多功能干細胞；細胞治療

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）09（a）-0098-03

Application Potential of Induced Pluripotent Stem Cells in Cell Therapy for Stroke

WENG Nan-chuan， ZHAN Ren-ya

Department of Neurosurgery， First Affiliated Hospital， Medical College of Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang Province， 310003 China

[Abstract] Objective To discuss the application potential of induced pluripotent stem cells （iPSCs） in cell therapy for stroke. Methods Under induction and reprogramming， differentiated adult cells can express one or some specific gene， thus changes into a kind of pluripotent stem cells， namely iPSCs. Results A certain degree of similarity can be found between iPSCs and embryonic stem cells stem （ESCs）， both of which have highly proliferative ability and multi-directional differentiation potential， for example， differentiation into neurons. Conclusion Without ethical problem and risk of immune rejection， iPSCs was simple to use and noninvasive， therefore it can offer hope for patients with stroke. This paper reviews the related research in recent years.

[Key words] Stroke Induced； Pluripotent stem cells for； Cell therapy

1 背景

腦卒中是造成人類死亡的三大疾病之一，在美國占人口死亡的第三位，在日本占第二位，在中國則占人口死亡的第一位。不僅腦卒中嚴重危害人類的健康，殘疾的幸存者也給人類社會帶來嚴重的經濟負擔。目前腦卒中的針對性治療主要包括手術或介入處理異常血管、溶栓、傳統的康復治療等。然而，溶栓的治療窗短：研究表明缺血性腦卒中發生后4.5 h內接受溶栓治療的病例得到明顯的臨床效益，而在48 h內接受治療的患者雖然得到一定效益，但是仍殘留嚴重的神經功能缺陷，特別是腦卒中急性期即出現尿失禁、GCS評分高及神經功能缺損嚴重的患者。傳統的康復治療，包括電生理治療，物理治療等的治療效果只能起到輔助作用。所以，一旦腦卒中發生，我們目前的治療方法逆轉神經功能缺陷悲慘結局的能力將十分有限。本文主要研究分析腦卒中細胞治療中誘導多功能干細胞應用潛力時，結合誘導多功能干細胞的腦卒中細胞的治療，并結合前人研究的現狀，綜述了關于腦卒中細胞治療的最新研究進展，現報告如下：

2 腦卒中的細胞治療

2.1 概況

干細胞與再生醫學在人類疾病及外傷的治療上正扮演著越來越重要的角色。腦卒中，由于其疾病過程中正常神經功能細胞的損害、丟失的特點，便是常見的細胞治療的研究對象。胚胎干細胞（ESCs）、神經前體細胞（NPC）、工程細胞等已用于之前的研究，它們假設這些細胞通過各種方式到達腦卒中病灶后，能修復神經通路、促進血管新生、抑制炎癥從而達到功能重建的目的。同時，這些細胞可能會分泌某些神經生長因子來促進神經的修復。越來越多的動物實驗和臨床前期研究出現，并證明了腦卒中細胞治療的巨大潛力。

2.2 研究現狀

迄今為止，有多種細胞已經用于腦卒中細胞治療的研究，并得到正性結論。這些細胞可以分為三類：①來自胚胎組織的NPC；②體內尚未分化的NPC；③來自骨髓、臍帶血或脂肪組織的ESCs。

研究表明NPC被移植到腦卒中病灶的實質后能生存、分化并改善神經功能 。hNT神經細胞來自于從一人畸胎得到的NT2細胞系，動物實驗中，將其注入腦卒中模型的病灶里亦能改善模型的神經功能.另外，有報道稱人體骨髓細胞、人體臍帶血細胞、脂肪間充質干細胞均有改善腦卒中后神經功能恢復的作用。

hNT神經細胞是目前唯一被臨床試驗的人體細胞。在一臨床I期試驗研究中，12例基底節腦卒中的患者被選中，年齡在44～74歲，他們在加入試驗前均存在穩定的神經運動功能的缺陷。在手術向腦卒中病灶注入hNT神經細胞后8周內，患者均接受免疫抑制治療。結果其中6例患者的歐洲中風評分得到改善。在一臨床II期試驗中，18例存在穩定神經功能缺失1～6年的基底節腦卒中患者被分為兩組，其中14位接受細胞治療，另4位作為對照組。所有18例患者均同時接受傳統的康復治療。結果治療組中6例患者在歐洲中風評分上得到明顯改善，但是治療組與對照組的歐洲中風評分不存在統計學上的差異。

2.3 存在的問題

關于腦卒中細胞治療的研究，存在著許多問題：腦卒中模型的選定和制作；使用確切的預后評定標準；細胞來源的選定（人或動物來源，胚胎或成人來源，大腦或其他部位來源）；治療窗的選定；治療劑量、注射方式的選定；治療并發癥的預防等等[2]。理想的狀況是能有一張標準的路線圖，所有研究的設計都參考這張指南路線圖，使得腦卒中的細胞治療研究達到高效、安全、統一的目標。

3 iPSCs的起源和研究進展

2006年，2012年諾貝爾獎獲得者Yamanaka首先利用逆轉錄病毒載體導入4種基因Oct3/4、Sox2、C-Myc和Klf4，通過將小鼠作為一種纖維細胞，并進行重新整編，產生和誘導多功能干細胞類似的一種多功能干細胞，這種多功能干細胞也即是iPSCs。但是伴隨著成人上皮成纖維細胞逐漸的誘導，并將其誘導為一種iPSCs。人體細胞誘導的過程中，注重慢性病毒作為一種特殊的載體。熊杰[1]等在干細胞治療神經退行性疾病的前景與問題中研究表明，誘導多功能干細胞逐漸成為全球范圍干細胞的一種熱點研究。

3.1 iPSCs的生物特性

所謂的iPSCs，劉文駿等[2]在導多功能干細胞治療脊髓損傷的現狀及思考中研究表明，借助于多能性標志分子Fbx15，在實際的表達過程中，結合一種轉染后的細胞，在多層篩選之后，使得iPSCs不僅僅存在一定的多向分化潛能，細胞在細胞形態以及生長特性的研究過程中，表面標志物更是基于一種畸胎瘤的特點，和小鼠ESCs有著一定的相似度，在基因表達的過程中，基于一種DNA甲基化的形式，在嵌合體形成過程中，不同于一種小鼠ESCs。

鄧君等[3]在誘導多功能干細胞在視網膜疾病中應用研究中表明，基于一種多能性標志分子，在分子的篩選過程中，不僅僅發現這種iPSCs實際的細胞形態有著不同，同時在生長特性和表面標志物的研究過程中，畸胎瘤往往和小鼠ESCs有著一定的相似性，基于一種DNA甲基化的方式，這種基因表達過程中，染色質的狀態也有著一定的差異性。秦潔[4]在誘導多能干細胞來源的神經干細胞移植治療腦出血的實驗研究中表明，基于人類成纖維細胞樣滑模細胞的結構特點，這種源自新生兒的一種纖維細胞，在細胞系誘導過程中，結合iPSCs實際的細胞形態，在增值能力培養的過程中，做好表面抗原標志的合理應用，在基因表達譜以及多潛能干細胞特異性基因的實際表觀過程中，基于一種遺傳學的形態，這種端粒酶活性往往和人體的誘導多功能干細胞有著直接性的相似度，基于一種體外培養的過程中，小鼠體內的畸胎瘤，在實際的形成過程中，存在不同的胚層，同時也存在不同的細胞類型。

郭子寬[5]在間充質干細胞及其臨床應用中的幾個問題的研究中表明，誘導多功能干細胞往往和IPSCs存在一定的相似度，基于一種多能性的特點，做好多種成體細胞的綜合性分化，在體外誘導的過程中，對功能的心肌細胞進行逐步的形成，在多種心血管細胞誘導的過程中，通過運動神經元細胞進行分化，同樣也分化成一種神經膠質細胞。

方敏等[6]在干細胞移植治療缺血性腦卒中的研究進展中分析表明，iPSCs對神經元細胞分化的過程中，基于一種神經膠質細胞，做好造血前體細胞的一種綜合性的分化，在造血前體細胞不斷的移植過程中，對于移植后的凝血功能有著根本上的改善過程。

3.2 iPSCs基礎研究的最新進展

病毒逆轉錄是誘導iPSCs的主要方法，這種病毒在實際的應用過程中，不僅僅存在逆轉錄病毒，同時也存在慢病毒，更是存在一定的腺病毒，病毒基因在實際的插入過程中，存在一定的不可控過程，對于原癌基因的激活有著直接性的影響過程，在各種方法據誒和的過程中，更要避免iPSCS誘導過程中的一種病毒感染，對基因的整合進行有效的避免。其中表達質粒、化學因子、“piggyback”轉座子[7]、“自體裂開”多肽[8]相對來說有著一定的成功性。而基于有利基因的載體以及細胞滲透性重組蛋白的相關應用，同樣也有著相對成功的效果[9]。

許多誘導因子本具有潛在致癌作用，所以減少誘導因子，優化誘導因子也是研究目標之一。從Nakagawa等和Wernig等的三個誘導因子，到Kim等的兩個誘導因子，再到Miura K等[10]只用Oct4一個誘導因子。研究的進步讓我們看到進一步優化誘導方法的可能。

4 關于iPSCs用于神經系統細胞治療的研究進展

iPSCs不僅僅具有無限生長潛能，同時也存在可自體來源的主要特點，在對道德倫理問題避免的過程中，基于一種免疫排斥的過程中，注重神經系統細胞治療過程中的全面研究和進展。同時細胞治療的熱門靶點也即是一種iPSCs。目前關于iPSCs用于神經系統細胞治療研究的疾病只有帕金森病和脊髓損傷。

4.1 iPSCs和帕金森病

Tsuji O[10]研究表明，小鼠iPSCs在對多巴胺能神經元分化之后，主要是在體外培養的過程中，將神經前體細胞全面得到，通過在帕金森病大鼠腦部各個部位進行合理的移植，在神經元和受體大鼠不斷接觸的過程中，結合一種神經元的特點，合理的改善帕金森病的相關癥狀。Nori S[11]研究表明，而基于一種纖維細胞的研究過程中，結合病因學和毒理學的相關研究，在成體細胞中，對人的iPSCs進行不斷的誘導，并逐漸的形成一種多巴胺能神經元，分化效率實際的檢測過程中，通過對帕金森病的相關特異性進行全面的檢測，并逐步的形成一種多巴胺能神經元的相關細胞。

4.2 iPSCs和脊髓損傷（SCI）

Kobayashi Y[12]等的研究發現鼠iPSCs能分化成神經球，而且其分化結果跟iPSCs的來源有關：鼠胚胎成纖維細胞來源的iPSCs最接近于ESCs分化成神經球的結果。于是翁南川等[13]運用鼠胚胎成纖維細胞來源的iPSCs分化來的神經球治療鼠脊髓損傷模型，發現iPSCs治療組的下肢運動功能恢復明顯優于對照組，并與ESCs治療組的療效等同。他們的研究暗示分化成熟組織來源的iPSCs經過嚴格的分化評估后可以用于治療SCI。此后，劉巍等[14]在干細胞治療終末期缺血性心肌病的進展中通過用人iPSCs分化來的神經球治療小鼠SCI同樣得到積極的結果。在這基礎上丁紅芳等[15]在絨猴模型上進行了類似的實驗研究，結果再次是iPSCs治療的絨猴下肢運動功能得到顯著恢復，并且未出現腫瘤事件。馮濤[16]等在干細胞的臨床應用：缺少大動物模型和人體試驗的研究中表明，iPSCs在某種程度上和ESCs存在一定的相似度，在多向分化的過程中，其中的潛能，往往將已知的成體干細胞超出。同時郭曉令[17]等在編程誘導多功能干細胞的研究進展中表明，基于人類成纖維細胞樣滑模細胞的結構特點，這種源自新生兒的一種纖維細胞，在細胞系誘導過程中，結合iPSCs實際的細胞形態。

5 展望

iPSCs作為一種細胞移植模型，有著理想性的特點，在體外高度增值的過程中，存在相對未成熟表型的一種可塑性，在實際的增值分化過程中，有著可控性的特點。同時iPSCs在某種程度上和ESCs存在一定的相似度，在多向分化的過程中，其中的潛能，往往將已知的成體干細胞超出，并基于一種倫理學的角度，對于患者疾病相關特異性的iPSCs，將免疫排斥問題有效避免。iPSCs在實際的取材過程中，不僅僅有著簡單性的特點，同時也存在無創的特點，在某種程度上很容易被患者接受。在再生醫學領域的發展過程中，iPSCs存在一定的競爭力，從根本上為再生醫學難題的解決帶來了一定的前景和希望。

但是，目前iPSCs治療腦卒中的研究還存在以下幾個問題：①iPSCs尚未解決的關于腦卒中細胞治療研究方法的問題：包括腦卒中模型的選定和制作；使用確切的預后評定標準；治療窗的選定；治療劑量、注射方式的選定等等。②iPSCs研究的不成熟：如病人特異性iPSCs誘導生成的低效率；iPSCs形成腫瘤的危險性等等。這些問題很有可能在不遠的將來被嚴密有效的分化和篩選技術所解決。③iPSCs實際來源過程中，主要是結合神經元對腦卒中進行治療的一種機制，iPSCs的科學研究正在飛速發展，相信人類的智慧將克服一個個難題，而iPSCs必定為腦卒中的細胞治療開辟一片新的天地。

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（收稿日期：2015-03-05）