茯苓中多糖含量的測定方法研究*

2015-10-16 01:04:53張文芳陳丹紅

福建輕紡 2015年5期

張文芳，陳丹紅

（福建省測試技術研究所，福建福州 350003）

茯苓中多糖含量的測定方法研究*

張文芳，陳丹紅

（福建省測試技術研究所，福建福州 350003）

篩選分光光度法測定茯苓中多糖含量的最優(yōu)條件，以便快速準確地進行茯苓產品質量評價。方法：采用苯酚—濃硫酸比色法測定茯苓中總糖含量；采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖法測還原糖含量，相減得多糖含量；同時分別從水浴時間，苯酚和濃硫酸用量等方面考察最優(yōu)條件；進行了精密度、重復性、穩(wěn)定性、加樣回收率等方面試驗。結果：茯苓總糖測定的最優(yōu)條件為6%苯酚1.0ml，濃硫酸5.0ml，沸水浴15 min；回歸方程為回歸的標準曲線方程為y=0.0056x，R2=0.9943；測茯苓還原糖的回歸的標準曲線方程為y=0.7720x，R2=0.9903。方法操作簡便，結果準確可靠，重復性好，可用作茯苓中多糖含量的測定。

茯苓；總糖; 還原糖; 多糖；紫外分光光度法

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf的干燥菌核,為我國傳統(tǒng)的常用中藥材，具有祛濕利尿、健脾和胃、補體強身、安神寧心的作用。茯苓主要化學成分為茯苓多糖、三萜類、樹膠、蛋白質和脂肪酸等化合物等。中外學者對茯苓的化學成分及生物活性進行研究，發(fā)現(xiàn)其所含的多糖與免疫功能的調節(jié)、細胞與細胞的識別、細胞間物質的運輸、癌癥的診斷與治療等，都有著密切的關系。大量研究表明植物多糖具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等多種生物學功效，而且對機體幾乎沒有毒性。天然多糖化合物作為一種免疫調節(jié)劑已越來越多地用于腫瘤、肝炎等疾病的治療和康復。而艾滋病的肆虐更使天然多糖化合物特別是它的強抗病毒活性的衍生物，成為科學家們尤其是藥物學家們高度重視的對象。茯苓中多糖的含量與藥效的關系極大，建立茯苓多糖的分析測定體系對于茯苓藥材的內在質量控制具有重要意義。文章與以前僅采用采用苯酚—濃硫酸體系測總糖的方法不同，扣除了還原糖的含量，得到茯苓多糖的真實含量。該方法簡便、快速，可為進一步研究茯苓種植質量和藥理活性提供分析數(shù)據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器（表1）

1.2 試劑

苯酚，濃硫酸：上海化學試劑有限公司，分析純；其余均為化學純，市售。

表1 實驗儀器

2 方法及結果

2.1 茯苓多糖測定方法的研究

2.1.1 原理

提取液中不僅含有多糖，還含有一些還原糖如單糖和寡糖，由于無法直接測得溶液中多糖的含量，因此用苯酚-硫酸法測得總糖含量，DNS法測得還原糖含量，然后兩者相減即得多糖含量。

茯苓多糖=茯苓總糖-茯苓還原糖

2.1.2 茯苓總糖測定---采用苯酚硫酸法

2.1.2.1 實驗原理

苯酚-硫酸試劑可與游離的單糖或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反應，己糖在490 nm（戊糖以及糖醛在480 nm）處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關系。多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。

2.1.2.2 標準曲線制作

（1）取9支干凈的試管，然后按照表2提供的數(shù)據(jù)加樣。

（2）加完樣后靜置20min，待顯色穩(wěn)定

（3）以0號試管為空白對照，于490 nm下測溶液的吸光值。

（4）樣品含量的測定：取一定量的待側樣品，加水補足2 mL，按上述步驟，測490 nm的光密度，以標準曲線計算總糖含量。

2.1.2.3 苯酚硫酸法測總糖含量的標準曲線（圖1）回歸的標準曲線方程為y=0.0056x，R2=0.9943。

2.1.3 還原糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖法

2.1.3.1 實驗原理

還原糖是指含自由醛基或酮基的單糖（如葡萄糖）和某些具有還原性的雙糖（如麥芽糖）。它們在堿性條件下，可變成非常活潑的烯二醇。遇氧化劑時，具有還原能力，烯二醇本身則被氧化成糖酸及其他產物。黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，反應液里棕紅色的深淺與還原糖的含量成正比，在波長為540 nm處測定溶液的吸光度，查對標準曲線并計算，便可求得樣品中還原糖的含量。（DNS溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定的范圍內還原糖的量和棕紅色物質顏色深淺的程度成一定的比例關系。（該方法操作簡單，快速，雜質干擾較少）。

表2

圖1 苯酚硫酸法測總糖含量的標準曲線

2.1.3.2 實驗試劑

3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：

甲液：溶解6.9 g結晶酚于15.2 mL10%氫氧化鈉溶液中，并用水稀釋至69 mL，在此溶液中加6.9 g亞硫酸氫鈉。

圖2 3.5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測還原糖含量的標準曲線

乙液：稱取255 g酒石酸鉀鈉加到300 mL10%氫氧化鈉溶液中，再加入880 mL1%3,5-二硝基水楊酸溶液。

將甲乙二溶液相混合即得黃色試劑，貯于棕色瓶中備用。在室溫放置7～10d以后使用。

2.1.3.3 標準曲線制作

(1) 取9支干凈的試管，編號0～8，分別按照表3加入試劑。

（2）加完樣后在沸水浴中加熱5min，取出，然后立即用流動冷水冷卻。

（3）待樣品冷卻完全后每管中加入21.5 mL蒸餾水，充分搖勻。

（4）以0號管為空白對照，于520 nm下測光吸收值。

（5）樣品含量的測定：取一定量的待側樣品加水補足2 mL，按上述步驟，測得其520 nm的光吸收值。根據(jù)標準曲線方程即可算出還原糖含量。

表3

2.1.3.4 3.5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測還原糖含量的標準曲線（圖2）

回歸的標準曲線方程為y=0.7720x，R2=0.9903。

2.2 茯苓多糖測定方法的優(yōu)化

2.2.1 對照品溶液制備：精密稱取105℃干燥恒重的葡萄糖50mg與50ml容量瓶中用水溶解并定容，搖勻。精密吸取5ml于50ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得 0.1mg.mL-1的對照品溶液。

2.2.2 苯酚用量選擇：精密稱取對照品溶液各1.0ml的5份，分別加入6%苯酚0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4 mL，混勻，每份分別緩慢加入濃硫酸5 mL并攪拌，充分搖勻，靜至5min后再置沸水浴中加熱15min，取出，冷卻至室溫，在490nm處測吸光度。結果如表4。選擇6%苯酚用量為1.0 mL。

2.2.3 濃硫酸用量選擇：精密稱取對照品溶液1.0ml的5份，各加入6%苯酚1.0ml，分別緩慢加入濃硫酸4.0，4.5 ， 5.0，5.5，6 mL，并攪拌，充分搖勻，靜至5min后再置沸水浴中加熱15min，取出，冷卻至室溫，在490nm處測吸光度。結果如表5。選擇濃硫酸用量為5.0 ml。

2.2.4 水浴時間選擇：精密稱取對照品溶液1.0mL的5份，各加入6%苯酚1.0mL，分別緩慢加入濃硫酸5.0 mL 并攪拌，充分搖勻，靜至5min后再置沸水浴中加熱分別為5、10、15、20、25min，取出，冷卻至室溫，在490nm處測吸光度。結果如表6。選取水浴時間為15min。

2.2.5 樣品的測試及精密度實驗：稱取同一批茯苓粉末（過60目篩）各1.0g 6份，按上述測定總糖和還原糖方法測定后相減得多糖含量，平行測定茯苓多糖含量為0.725 mg.mL-1，RSD為1.07%(n=6)，結果見表7，表明精密度良好。

2.2.6 加樣回收率實驗及標準偏差：稱取同一批茯苓粉末（過60目篩）各1.0g 3份，分別加入葡萄糖供試品10 mL（1 mg.mL-1）的母液。按最優(yōu)的測定條件測總糖和還原糖，測定后相減得多糖含量，平行測定3次茯苓多糖的回收量，計算得平均回收率為：102.39%，RSD為0.36%(n=3)，表明回收率良好,結果見表8。

表4 6%苯酚不同用量實驗結果

表5 濃硫酸不同用量實驗結果

表6 水浴不同時間實驗結果

2.2.7 穩(wěn)定性試驗：精確稱取同一供試液1 mL，按含量測定方法的最佳條件操作，以試劑空白作對照，每隔30min 測一次吸光度，考察樣品3h內的穩(wěn)定性，結果表明供試樣品在3小h內顯色穩(wěn)定。

3 結論

采用苯酚—濃硫酸比色法測定茯苓中總糖含量；采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖法測還原糖含量，相減得多糖含量；建立的這個方法體系測量結果比用苯酚—濃硫酸比色法算多糖的結果更精確；方法的重現(xiàn)性，穩(wěn)定性，精密度，回收率都達到了檢測要求，該方法未見報道可作為茯苓產品質量監(jiān)控的有效方法。