大腸桿菌中重組尖吻蝮蛇類凝血酶的純化及鑒定

程欲+++劉樹滔++饒平凡

摘要：尖吻蝮蛇類凝血酶直接裂解纖維蛋白原且不激活凝血因子表現出良好抗凝效應，是重要的血栓類藥物。大腸桿菌中高效表達重組尖吻蝮蛇類凝血酶，通過陰離子層析（DEAE650M，0.02M PBS+0.2M NaCl洗脫）和親和層析（鎳柱，0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脫），獲得較純樣品。利用腸激酶酶切、纖維蛋白凝結活性、免疫印跡方式鑒定純化樣品為活性目的蛋白。此結果為商品化生產、應用類凝血酶提供思路及方向。

關鍵詞：類凝血酶 純化 鑒定

中圖分類號：G64 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）07（b）-0000-00

類凝血酶（thrombin-like enzyme）是一種絲氨酸蛋白酶[1-2]，作用于纖維蛋白原，使其產生側鏈不交聯的片段。該片段易被網狀內皮系統吞噬或正常纖溶作用清除[3-4]，而不激活凝血因子，具有重要醫藥價值。受限于天然活體來源及復雜的復雜純化條件，蛇毒類凝血酶在血栓類藥物研發中難以突破[5]。本文利用工程菌構建、表達出尖吻蝮蛇類凝血酶，研究其純化條件，鑒定其純化效果，以期大量、高效獲得活性蛋白，應用于商品化生產、利用。

1 材料與方法

1.1菌株

穩定表達尖吻蝮蛇類凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）由福州大學生物工程研究所保存。

1.2試劑與儀器

離子交換樹脂填料DEAE650M、親和層析組氨酸填料（His鎳柱）保藏于福州大學生物工程研究所；重組腸激酶（EK酶）購于invitrogen公司產品；牛纖維蛋白原購于Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

蛋白純化系統及恒壓恒流電泳儀購于東方特力科貿中心；Mini PROTEIN II電泳槽購于美國BIO-RAD公司。

1.3重組類凝血酶表達

穩定表達尖吻蝮蛇類凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）于LB+培養基（LB培養基添加有氨芐青霉素），30℃，誘導劑IPTG濃度為0.5 mmol·L-1條件下培養3h[6]，獲取重組蛋白.。

1.4重組類凝血酶純化

1.4.1陰離子層析——DEAE650M

綜合預實驗結果，將重組菌破碎液通過陰離子層析柱（DEAE650M），通過添加0.1M、0.2M、0.3M、0.5M和0.7M NaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（PBS緩沖液）階梯洗脫，收集峰樣用紫外分光光度計測定OD280，并記錄數據、繪制曲線圖譜，以此獲得初步純化樣品，-20℃保藏備用. 。

全過程中使用緩沖液如表1所示。

試劑 組成

平衡緩沖液 20mM PBS（pH7.5）

洗脫緩沖液 20mM PBS（含不同濃度NaCl）

1.4.2親和層析——鎳柱

利用重組融合蛋白表達標簽（六個His殘基序列）能夠與二價金屬離子（如鎳、鋅等）螯合，達到特異性吸附、分離功效。將陰離子層析收集含有目的蛋白樣品，通過鎳柱親和層析再次純化，全過程使用緩沖液如表2所示。樣品經紫外分光光度計測定OD280，記錄數據并繪制曲線圖譜，收集純化樣品，-20℃保藏備用。

試劑 組成

鎳柱活化緩沖液 0.1M NiSO4緩沖液

平衡緩沖液 20mM PBS（pH8.0）

洗脫緩沖液 20mM PBS（含不同濃度咪唑、0.5M NaCl）

1.5重組類凝血酶鑒定

1.5.1 SDS-PAGE

采用不連續凝膠檢測，分離膠濃度12.5%，蛋白條帶用考馬斯亮藍染色[7]。

1.5.2纖維蛋白凝結活性

1mg· mL-1的純化產物與9mg·mL-1的牛纖維蛋白原（均溶解于Tris-HCl緩沖溶液，pH7.0，）37℃孵育1h，觀察凝結現象。同時以純水、牛纖維蛋白代替目標蛋白作對照組[8-9]。

1.5.3腸激酶酶切

pET32a載體在融合硫還原蛋白與自身蛋白間存在腸激酶酶切位點。取純化樣品100μl加入1U腸激酶，輕混后37℃溫浴2h，利用腸激酶酶切特性，將融合蛋白酶分成兩個片段，而后通過SDS-PAGE電泳對片段分子量測定，初步驗證重組融合蛋白。實驗以純水代替腸激酶作為空白對照組。

1.5.4免疫印跡

純化樣品經SDS-PAGE電泳后割下相應凝膠，利用電轉法將蛋白轉移至PVDF膜（電泳-割膠-轉膜）；而后轉移至封閉液中，室溫下振搖1h（免疫：封閉）；取出、吸凈殘液，將蛋白面浸沒于一抗液，室溫孵育1h，而后用TBST室溫下振搖兩次，每次10min，再用TBS室溫下振搖10min（免疫：一抗反應）；取出、吸凈殘液，用二抗液室溫孵育1-2h，而后再用TBST室溫下振搖兩次，每次10min，TBS室溫下振搖10min，取出進行顯色（免疫：二抗反應）.）。

2 結論

2.1重組類凝血酶純化

2.1.1陰離子層析——DEAE650M

誘導表達后菌體經超聲波破碎、高速離心，結果顯示目的蛋白大部分存在于上清液（前期預實驗已驗證），為可溶性蛋白。根據蛋白質間理化性質差異，經不同鹽溶液階梯洗脫，檢測OD280，收集峰樣，繪制曲線，如圖1所示。為判定收集樣品中蛋白分布，經SDS-PAGE檢驗，如圖2所示。

通過ExPASy-Compute pI/Mw計算可知，尖吻蝮蛇類凝血酶理論分子質量為44.3kDa，對比電泳圖譜可知0.02M PBS+0.2M NaCl洗脫條件下得到主要目的蛋白樣品（D2），收集此峰樣用于再次純化 。

2.1.2親和層析——鎳柱

粗純化類凝血酶樣品（D2）通過鎳柱親和層析，在不同咪唑濃度條件下階梯洗脫，收集樣品，檢測OD280繪制曲線，如圖3所示。獲得峰樣，通過SDS-PAGE檢測，如圖4所示。 電泳圖譜中N2樣品（0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脫）在目的蛋白理論分子量處存在較為單一條帶，推斷經過兩步操作，可獲得較純尖吻蝮蛇類凝血酶樣品。

2.2重組類凝血酶驗證

2.2.1腸激酶酶切

表達蛋白樣品與腸激酶在37℃條件下反應1h，利用SDS-PAGE檢測，如圖5所示。融合蛋白被剪切為分子量18kDa和26kDa兩部分，且目的蛋白處存在明顯因剪切而減少的痕跡，此現象與預期構建結果相契合。一定程度上表明，表達蛋白即尖吻蝮蛇類凝血酶（Rosetta-pET32-acutobin）。

2.2.2纖維蛋白凝結活性

利用試管法[8-9]處理樣品，如圖6所示 。陰性實驗組（空白對照組，超純水）樣品呈現澄清透明狀液體，陽性實驗組（牛凝血酶）呈現明顯渾濁膠狀，樣品組（純化目標蛋白）呈現與陽性實驗組相似渾濁膠狀。

結果表明，重組蛋白pET32a-acutobin對牛纖維蛋白原具有特異酶活性，能使其出現白色渾濁狀態，但無法真正形成凝固。其凝結效果與天然類凝血酶活性間仍存在差距。

2.2.3免疫印跡（Western blotting）

經過兩步純化后樣品，借助His標簽抗體進行免疫印跡反應，結果如圖7所示。N2樣品條帶均是帶有His標簽的相關蛋白質，推斷理論分子量處條帶為類凝血酶pET32a-acutobin，其余條帶可能為多個目的蛋白集合體（上端）和目的蛋白分離體（下端）.。

3 結語

綜上實驗結果表明，利用工程菌重組表達類凝血酶，經純化應用于實際生活的思路是可行且有成效的。依托工程菌的高效表達，以較低的環境代價為前提可獲得大量用于醫療的血栓類藥物，解決了直接由活體動物提取的道德問題、提取量少、純化不易等瓶頸問題。通過簡單的兩步純化，能夠很好的排除雜質干擾，得到較為單一且具有活性的目的蛋白，既優化工藝又節省成本。然而，酶活力驗證實驗發現目前純化后重組蛋白的活力相較于成熟商品化產品仍存在差異。然而，酶活力驗證實驗發現目前純化后重組蛋白的活力相較于成熟商品化產品仍存在差異。

重組類凝血酶（Rosetta-pET32-acutobin）要正式推向市場，現階段仍需解決酶活力提升[10]、保存問題，熱源性、致敏性物質去除問題等 。同時，相較于原核體系大腸桿菌胞內表達的類凝血酶，可利用重組手段構建胞外分泌真核體系目的蛋白從純化及適用性角度提升其整體價值。

參考文獻

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