超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜快速篩查保健品中23 種非法添加西藥成分

張曉光，李　強，孫　磊，夏　靜，張　巖，*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050091；2.河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091）

超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜快速篩查保健品中23 種非法添加西藥成分

張曉光1，2，李強1，2，孫磊1，2，夏靜1，2，張巖1，2，*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050091；2.河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091）

建立基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜的快速篩查和確證保健品中可能非法添加的23 種降壓類西藥成分的方法。樣品經過甲醇提取，用Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以甲醇和體積分數0.1% 甲酸溶液作為流動相進行梯度洗脫，采用正、負離子同時切換的掃描模式，在9 min內實現23 種西藥成分 的檢測。在全掃描模式下測定目標化合物的精確相對分子質量，與理論精確相對分子質量對比，相對質量偏差在 0.2×10－6～2.8×10－6之間，有效地去除了基質干擾；建立了23 種西藥成分二級質譜數據庫，實現對23 種西藥成分的定性篩查及同步定量。添加水平為0.2、0.5 μg/kg和5.0 μg/kg時， 方法的回收率范圍在72.3%～118.2%之間，相對標準偏差在0.5%～8.4%之間，檢測限在0.2～0.5 μg/kg之間。該方法可以作為降壓功效保健品中非法添加的西藥成分的高通量篩選和確認檢測方法。

超高效液相色譜；靜電場軌道阱高分辨質譜系統；降壓類藥物；保健品

近年來，保健品產業迅速發展，其中用于輔助降壓的保健品尤為居多，根據我國食品衛生法的相關規定，保健品中嚴禁添加任何西藥成分，但仍有部分生產廠家為追求利益，向具有降壓類保健品中違規添加西藥成分。患者在不知情的情況下服用此類保健品，可能會對身體造成心跳加速、頭疼、嘔吐、貧血、顱內壓增高、傳導阻滯、出現幻覺、肝硬化等嚴重危害［1-3］。為遏制保健品中非法添加西藥的行為，國家食品藥品監督管理局于2009年頒布了降壓類中成藥中非法添加化學藥物檢驗方法，但該方法僅適用于7 種常見降壓藥物的檢測［4］。由于降壓類新藥的不斷出現，非法添加的西藥成分越來越復雜，并且非法添加西藥成分種類呈現擴大趨勢，因此研究快速準確篩查和精確定量降壓藥中非法添加西藥成分的方法是很有必要的。目前，對于降壓藥中非法添加的西藥成分的測定方法多為液相色譜法［5-6］、液相色譜-質譜聯用法［7-10］、氣相色譜-質譜聯用法［11］，檢測的非法添加西藥種類較少，樣品前處理復雜，且由于儀器性能限制問題，檢出限無法滿足要求，存在造成假陽性誤判風險。

靜電場軌道阱高分辨質譜是近來發展起來的新式的質譜，它的原理是利用不同物質在阱中運動軌跡不同而實現目標物的精確定量。它具有分辨率、靈敏度高的特點，能提供精確相對分子質量，可一次性采集高通量的數據，滿足檢測需求，由此彌補傳統三重四極桿質譜方法檢出限低、假陽性誤判的不足；其數據依賴性掃描可以在篩查的同時，通過碎片離子進行定性確證［12］。近年來靜電場軌道阱高分辨質譜在食品農藥及生物毒素檢測［13-17］、紡織品中禁用物質檢測［18-19］、化妝品中激素檢測［20］、代謝組學［21-22］等領域已開始應用，但在降壓藥物檢測方面的應用未見報道。

本實驗利用高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜快速檢測保健品中可能非法添加的23 種降壓西藥成分，采用全掃描和正、負離子切換模式進行測定，通過提取的二級質譜進行定性，提取一級質譜的精確相對分子質量進行定量，利用基于母離子列表的數據依賴采集構建二級質譜庫保證了測定結果的準確性。該方法用實際添加實驗進行驗證，在較低質量濃度添加水平條件下仍可以保證良好的檢測結果。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

保健品 市購；23 種西藥標準品（純度≥95%）中國食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸（色譜純） 德國Merck公司；實驗用水為去離子水；標準儲備液用甲醇配制，系列標準工作溶液用甲醇-水（1∶9，V/V）配制。

1.2儀器與設備

Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（配有H-ESI Ⅱ源）、Ultimate 3000液相色譜系統 美國Thermo Fisher Scientifi c公司。

1.3方法

1.3.1樣品前處理

準確稱取一定量降壓類保健品（固體樣品2.0 g、液體樣品5.0 g、膠囊狀態樣品除去囊殼后稱量），精確至0.01 g，于50 mL離心管中，加5 mL水、25 mL甲醇，40 ℃渦旋混勻，超聲提取15 min。冷卻后用甲醇定容至50 mL。10 000 r/min離心5 min，取上清液25 mL，于45 ℃水浴條件下氮氣吹干。準確加入甲醇1.0 mL，渦旋30 s，過0.45 μm有機濾膜到進樣瓶中，供液相色譜-質譜儀測定。

1.3.2儀器條件

1.3.2.1色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）。流動相：A，甲醇；B，體積分數0.1%甲酸溶液。梯度洗脫，洗脫程序：0～0.5 min，10% A；0.5～3.0 min，10%～95% A；3.0～7.5 min，95% A；7.5～8.0 min，95%～10% A；8.0～9.0 min，10% A。流速0.30 mL/min；柱溫：室溫；進樣體積2 μL；分析時間9 min。

1.3.2.2質譜條件

電噴霧離子源溫度310 ℃；毛細管電壓3 800 V（正、負離子同時進行模式）；一級質譜駐留時間100 ms；二級質譜駐留時間50 ms；質量掃描范圍：m/z 200～700；分辨率（R）：70 000；掃描模式：全掃描+自動觸發二級質譜掃描；氣化溫度300 ℃；鞘氣壓（N2）35 arb；輔助氣壓（N2）10 arb；離子傳輸管溫度320 ℃；二級質譜采用自動觸發方式產生碎片離子，碰撞裂解氣為高純氮氣，碰撞能量為35%。

2　結果與分析

2.1樣品的提取與色譜柱的選擇

樣品提取可以選擇的溶劑有水、甲醇、乙腈、乙醇等。根據23 種化合物的物理溶解性質，決定采用水加有機溶劑的混合溶液作為提取溶劑，選取了具有代表性的固體樣品和液體樣品，加入23 種西藥成分混合標準品至1 μg/g，以1.3.1節方法進行樣品前處理，以平均加標回收率對比甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水3 種溶劑體系，發現以甲醇-水作為混合溶劑提取時23 種西藥成分平均回收率相對較高，最終選取了甲醇-水混合溶劑進行提取。在色譜柱的選擇方面，比較了不同類型的C18反相色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Broshell 120 SB-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）、Hypersil Gold C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），在相同的液相體系條件下，Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Broshell 120 SB-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）均能實現較好分離度，而Acquity UPLC BEH C18柱用時更短；從分離效果和出峰時間兩方面綜合考慮，最終選擇了Acquity UPLC BEH C18柱。

2.2快速篩查驗證及譜庫的建立

2.2.1理論精確相對分子質量的驗證

正負離子掃描有不分段切換和分段切換2 種方式，在常規多目標物定量分析時常采用正、負離子切換方式以提高分析檢測的通量。本方法為避免分段式采集容易出現的保留時間漂移導致漏檢的現象，提高篩查的準確性，采用正、負離子切換不分段全掃描的方式，23 種降壓藥出峰圖譜見圖1，23 種降壓藥物色譜-質譜檢測在9 min內完成，同時保持較好的質量精度。正、負離子同時采集的質量精度見表1。

表1　23種化合物同時采集的質譜分析參數Table1　Analytic parameters of 23 target compounds using UPLC Orbitrap MSap MS

表1中，23 種物質中吲達帕胺、氫氯噻嗪、氯沙坦鉀為負模式掃描，其余均為正模式掃描。負模式掃描得到為［M－H］－圖譜，正模式掃描得到［M+H］+圖譜，鹽酸可樂定、鹽酸貝那普利、鹽酸哌唑嗪、鹽酸尼卡地平均為去掉［HCl］基團精確相對分子質量，馬來酸依那普利為去掉［C4H4O4］基團得到的精確相對分子質量；苯磺酸氨氯地平為去掉［C6H6O3S］基團得到的精確相對分子質量；酒石酸美托洛爾分子式以［C15H25NO3］計［23］，在分辨率為70 000的情況下，23 種降壓藥物精確度相對質量偏差在0.2×10－6～2.8×10－6之間（表1），相對分子質量變化較小，可以滿足根據保留時間，理論相對分子質量和多電荷同位素特征峰對樣品進行快速篩查［24-25］。

圖1　23種目標化合物提取一級質譜圖Fig.1 Mass spectra of 23 target compounds

2.2.2篩查準確性的驗證

采用Extract Finder軟件對保健品中西藥成分進行初步篩查，首先構建降壓類藥物化合物列表，設置相應的檢索參數，如保留時間、相對分子質量偏差、二級質譜匹配度等。軟件會計算實際樣品和理論標準品之間的分子離子的精確相對分子質量偏差、同位素分布匹配度、同位素比例和保留時間偏差，綜合多個參數進行評價，對于檢索結果得分不小于70的化合物，本方法確認其為陽性樣品。

2.2.3基于二級質譜圖庫的篩查方法的建立

使用高分辨質譜分析藥物，只采集一個母離子不能滿足相關法規指令中規定的定性最低要求，必須進行二級質譜掃描獲得足夠多的定性信息。圖2是23 種降壓藥物標準樣品的二級質譜圖。利用Exact Finder軟件將23 種標準品的二級譜圖建立成二級質譜庫，以保留時間、一級精確相對分子質量、二級圖譜匹配度、同位素峰形匹配度等4 個指標作為打分依據，將4 個指標設定不同的閾值，實際樣品分析可以通過軟件進行打分判定，綜合打分不小于70 分即判定為疑似陽性樣品。

圖2　23種目標化合物標準樣品的二級質譜圖Fig.2　Tandem mass spectra of 23 target compounds

2.3同步定量方法的線性范圍、檢測限、回收率和精密度

本方法在快速篩查的基礎上通過提取一級質譜的精確相對分子質量進行定量從而實現同步定量分析，無需陽性樣品的重新定量分析。

以23 種降壓藥物質標準品的峰面積為縱坐標，相應的質量濃度（ng/mL）為橫坐標，進行線性回歸計算，得到線性方程和相關系數。23 種分析物的線性方程相關系數均大于0.99。確定該方法的檢出限、定量限、線性方程、線性范圍具體數據見表2。

表2　23種化合物線性方程、檢測限及定量限Table2　Regression equations with correlation coefficients， LOD and LOQ for 23 target compounds

表3　23種降壓藥物的回收率和精確度Table3　Recoveries and RSDs of 23 target compounds spiked into blank matrix sample

在空白基質中添加23 種降壓藥物標準溶液，添加水平分別為0.2、0.5 μg/kg和5 μg/kg，每個添加水平平行測定6 次，回收率范圍在72.3%～118.2%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）范圍為0.5%～8.4%；23 種降壓藥物在3 個水平條件下的回收率和精密度實驗結果見表3。

2.4實際樣品的測定

利用本方法對購自超市的10 個不同品牌的10 份保健品進行了篩查分析，均未檢出上述23 種降壓類西藥成分。

3　結 論

本實驗利用高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜對保健品中可能非法添加的降壓類藥物進行測定，9 min內可完成23 種降壓類藥物的高通量篩選和確認。高分辨率質譜在樣品分析中消除了基質干擾，提高了定性和定量的準確性，自動觸發全掃描二級質譜進一步提高了定性的準確性。以精確相對分子質量和二級質譜圖為基礎，構建了降壓類藥物數據庫，建立了保健品中非法降壓類藥物的快速篩查和確證方法。該方法靈敏度較高，并且自建的質譜數據庫可以不斷擴充。該方法作為一種快速篩選和確證檢測技術必將在保健品中非法添加物篩查和確認中得到廣泛應用。

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Rapid Screening and Confirmation of 23 Illicit Western Medicine Components in Health Food Products by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

ZHANG Xiaoguang1，2， LI Qiang1，2， SUN Lei1，2， XIA Jing1，2， ZHANG Yan1，2，*
（1. Hebei Food Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050091， China；2. Key Laboratory of Food Safety of Hebei Province， Shijiazhuang 050091， China）

A high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry（Orbitrap MS） method was developed for rapid screening and detection of 23 illicit western medicine components with antihypertensive effi cacy in health foods. The samples were extracted with methanol， and the extracts were then separated on an Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） using a binary solvent system composed of methanol and 0.1% formic acid in water by gradient elution. Both positive ion scan mode and negative ion scan mode were used to detect 23 western med icine components within 9 m inutes. The relative molecular masses of the target compounds were obtained in full scan mode with a relative deviation in the range of 0.2×10-6to 2.8×10-6compared to the theoretical value， indicating effective elimination of the matrix interference. Tandem mass spectrometric database based on characteristic fragment ions for the 23 western medicines was built. This method allowed qualitative screening and quantitative analysis at the same time. Recoveries of the proposed method were in range of 72.3%-118.2% at spike levels of 0.2， 0.5 and 5.0 μg/kg with relative standard deviations （RSDs） between 0.5% and 8.4%， and the limits of detection were between 0.2 and 0.5 μg/kg. As a high-throughput and confi rmatory method， it is useful for the determination of illicit western medicines as antihypertensive agents in health foods.

ultra high performance liquid chromatography （UPLC）； orbitrap high resolution mass spectrometry；antihypertensive medicines； health food products

TS207.3

A

1002-6630（2015）14-0187-05

10.7506/spkx1002-6630-201514036

2014-12-10

河北省科技條件建設項目（13965504D）

張曉光（1983—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：daniou2002@foxmail.com

張巖（1979—），男，高級工程師，博士，研究方向為化學生態學。E-mail：snowwinglv@126.com