手性色譜法測定L-乳酸鋅

何悅銘，王　杉，揭琴豐，邱偉華，黃曉婉，鄧澤元，*

（1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029）

手性色譜法測定L-乳酸鋅

何悅銘1，王杉2，揭琴豐2，邱偉華2，黃曉婉1，鄧澤元1，*

（1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029）

研究高效液相色譜法測定乳酸鋅中L-乳酸鋅含量的方法，并對此方法學進行探討。采用OA-5000手性色譜柱，1 mmol/L CuSO4·5H2O溶液為流動相，流速為1 mL/min進行色譜分離DL-乳酸鋅，分離效果好。L-乳酸鋅在0.147～3.675 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達0.99 9 9（n=6）；精密度 實驗相對標準偏差為0.044%；穩(wěn)定性實驗相對標準偏差為0.061%；平均回收率達（99.8±1.90）%，相對標準偏差僅為1.90%。表明此方法操作簡便，結(jié)果準確可靠，可用于L-乳酸鋅的準確測定和品質(zhì)監(jiān)控。

高效液相色譜法；乳酸鋅；手性

乳酸鋅作為一種補充微量元素鋅的新型營養(yǎng)強化劑，無臭、味甘甜，且價格適中；其相對于硫酸鋅等補鋅劑更易被人體吸收，對腸道無刺激［1-3］，具有增強食欲［4］、促進生長發(fā)育、提高肌體免疫力［5-6］和維持皮膚健康［7］等作用，可廣泛用于食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域［8］。現(xiàn)代工業(yè)中乳酸鋅主要是通過氧化鋅與乳酸反應(yīng)，硫酸鋅與乳酸鈣合成［9］而得。

合成乳酸鋅的乳酸中含有一個手性碳原子，因此具有旋光性［10］。人體和動物體內(nèi)存在的L-乳 酸脫氫酶只能代謝L-乳酸，不能分解吸收D-乳酸［11］。攝入過量的D-乳酸或DL-乳酸會致使血液中含較多D-乳酸，造成體 液中酸度過高，繼而出現(xiàn)機體疲勞，代謝紊亂，甚至引起酸中毒等癥狀［12-13］；世界衛(wèi)生組織明確規(guī)定人體每天攝取控制在100 mg/kg以下［14］。我國市場生產(chǎn)的乳酸主要是用發(fā)酵法［15-16］或化學合成法，大多是DL-乳酸制品。由此建立對乳酸鋅及其制品準確測定L-乳酸鋅的方法，對于控制品質(zhì)、提高食品安全及監(jiān)督水平具有重要的意義。

大多研究利用手性添加劑或衍生化反應(yīng)對手性化合物進行拆分［17-20］，實驗過程較為繁瑣；因此近年已有許多研究利用手性固定相將對映體進行直接拆分［21-22］。Sumichiral OA-5000手性色譜柱是在反相模式中通過配位交換相互作用進行手性識別，其手性配位體是青霉胺涂敷在ODS硅膠表面，因此限制了添加到流動相的有機溶劑用量，而且流動相中必須包含Cu2+離子。從手性識別機理分析，氨基酸、羥基酸等待分離物與手性固定相、中心金屬離子三者形成配位絡(luò)合物（非對映體復合物），由于非對映體絡(luò)合物相對穩(wěn)定性不同而致使表現(xiàn)對映體分離的選擇性［23］；因此該柱能有效地分離羥基酸的對映異構(gòu)體，在應(yīng)用于D-乳酸、L-乳酸異構(gòu)體及其衍生物的分離中極為廣泛。

目前尚無文獻報道直接分離測定D-乳酸鋅、L-乳酸鋅的方法。本實驗采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，利用OA-5000手性色譜柱來分離D-乳酸鋅和L-乳酸鋅，用標準曲線法測定L-乳酸鋅的光學純度，希望建立一種快速簡便、重復性好，結(jié)果準確可靠測定L-乳酸鋅光學純度的方法。

1　材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸鋅樣品 高郵市申夏生物技術(shù)有限公司、南通飛宇生物科技有限公司、南通勵成生物工程有限公司、上海申夏生物工程有限公司、鄭州瑞普生物工程有限公司、江西武藏野生物化工有限公司；L-乳酸鋅標準品（純度≥98%） 成都艾科達化學試劑有限公司；五水硫酸銅（純度≥99.5%） 日本和光純藥工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

自動進樣1100 HPLC儀 美國Agilent公司；SUMICHIRAL OA-5000手性色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 日本住友化學株式會社；AL104電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1 色譜條件

SUMICHIRAL OA-5000手性色譜柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動相：0.6～1 mmol/L CuSO4·5H2O［20-21］；檢測波長254 nm；流速0.7～1.0 mL/min；柱溫20～40 ℃；進樣量5 μL［24-25］。

1.3.2 定量與分離

精密稱取樣品0.250 g，置于100 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，搖勻。將配制好的溶液進行HPLC色譜分離，進樣量為5 μL。

L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\的質(zhì)量分數(shù)w，按下式計算：

式中：AL為L-乳酸鋅的色譜峰面積；AD為D-乳酸鋅的色譜峰面積。

1.3.3L-乳酸鋅標準曲線的繪制

精密稱取0.375 g L-乳酸鋅標準品，置于100 mL容量瓶中，用流動相定容得到3.75 mg/mL儲備溶液。精密量取儲備溶液0.4、2、4、6、8、10 mL分別置于10 mL容量瓶中，加流動相定容，配制成0.15、0.75、1.50、2.25、3.00、3.75 mg/mL，經(jīng)過濾膜（0.22 μm）后進樣。以L-乳酸鋅峰面積為縱坐標，標準品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 定量限與檢測限

取質(zhì)量濃度0.316 mg/mL標準品溶液，用流動相成比例稀釋后進樣。以RSN≥10時，測得此色譜條件下的定量限；RSN≥3時測得檢測線。

1.3.5 精密度實驗

取線性關(guān)系條件下2.5 mg/mL標準品溶液，重復進樣6 次，以L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 穩(wěn)定性實驗

取線性關(guān)系條件下2.5 mg/mL標準品溶液和乳酸鋅樣品溶液，放置0、4、8、12、24、48 h和72 h后進樣測定，以L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量計算RSD。

1.3.7回收率實驗

配制乳酸鋅樣品溶液，分別加入高、中、低劑量的L-乳酸鋅標準品。標準品加入量：1）低劑量為0.113 g（樣品取樣量的75%）；2）中劑量為0.150 g（樣品取樣量的100%）；3）高劑量為0.188 g（樣品取樣量的125%），每個梯度測定3 次，計算回收率。

1.4統(tǒng)計分析

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化結(jié)果

初始色譜條件選用流動相CuSO4·5H2O濃度為0.60～1.0 mmol/L，流速為0.70～1.0 mL/min，柱溫為20～40 ℃進行優(yōu)化實驗。通過紫外全波長掃描得到乳酸鋅在波長254 nm處有最大吸收，且由于CuSO4·5H2O在低溫條件下易發(fā)生結(jié)晶，優(yōu)化后最終選用色譜條件為流動相為1 mmol/L CuSO4·5H2O，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，測定效果最好。

2.2L-乳酸鋅標準曲線的繪制

以進樣量（X）為橫坐標，L-乳酸鋅峰面積（Y）為縱坐標，繪制成標準曲線（圖1）。L-乳酸鋅標準曲線回歸方程：Y=218.52X+19.054，R2為0.999 9，線性范圍：0.147～3.675 mg/mL，在此范圍內(nèi)峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系。

圖1　1L-乳酸鋅標準曲線圖Fig.1　Standard curve of L-zinc lactate

2.3專屬性實驗

取光學純度大于96%的L-乳酸鋅溶液進樣并記錄色譜圖，確定分離度。D-乳酸鋅、L-乳酸鋅峰分離度為5.27（不小于1.5）；L-乳酸鋅峰的理論塔板數(shù)為5 003（不小于5 000）。L-乳酸鋅保留時間為20.846 min，D-乳酸鋅保留時間為27.426 min。表明D-乳酸鋅和L-乳酸鋅分離效果良好（圖2）。

圖2　2D--乳酸鋅、L-乳酸鋅專屬性高效液相圖譜Fig.2　Typical HPLC chromatograms of D-zinc lactate and L-zinc lactate

2.4定量限與檢測限

測定按比例稀釋后溶液的信噪比。當RSN≥10時，測得L-乳酸鋅定量限質(zhì)量濃度為3.10×10－2mg/mL；當RSN≥3時，測得L-乳酸鋅檢測限質(zhì)量濃度為1.23× 10－2mg/mL。

2.5精密度

按照1.3.5節(jié)配制3 組精密度測試溶液，每組進樣6 次，以L-乳酸鋅含量計算，得到RSD為0.044%（遠小于5%），表明方法的精密度較高（表1）。

表1　1L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量測定的精密度實驗結(jié)果Table1　Precision of experimental data for the proportion of zinc L-lactate relative to total zinc lactate

2.6穩(wěn)定性

按照1.3.6節(jié)配制3 組穩(wěn)定性測試溶液，放置0、4、8、12、24、48 h和72 h后進樣測定，計算標準溶液L-乳酸鋅峰面積RSD為0.061%（遠小于5%），樣品溶液L-乳酸鋅峰面積RSD為0.074%；結(jié)果表明該方法測定L-乳酸鋅有較好的穩(wěn)定性（表2）。

表2　2L-乳酸鋅測定的穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table2　Results of stability tests

2.7回收率

按照1.3.7節(jié)配制回收率測試溶液，分別加入樣品量75%、100%和125%的標準品，每個加入量進行3 組平行，計算得L-乳酸鋅平均回收率為99.8%（在規(guī)定80%～120%之間），表明該法具有較高回收率（表3）。

表3　3L-乳酸鋅回收率實驗Table3　Results of spiked recovery tests

2.8樣品L-乳酸鋅含量測定

采用該色譜條件測定各樣品L-乳酸鋅含量。高郵市申夏生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的L-乳酸鋅含量為（99.55±0.071）%，南通飛宇生物科技有限公司的L-乳酸鋅含量為（99.49±0.014）%，南通勵成生物工程有限公司的L-乳酸鋅含量為（99.43±0.007）%，上海申夏生物工程有限公司的L-乳酸鋅含量為（99.48±0.049）%，鄭州瑞普生物工程有限公司的L-乳酸鋅含量為（99.51±0.014）%，江西武藏野生物化工有限公司的L-乳酸鋅含量為（49.11±0.17）%。

3　結(jié) 論

該色譜條件下測定L-乳酸鋅和D-乳酸鋅的分離度達5.27且L-乳酸鋅有良好的專屬性；L-乳酸鋅檢測限質(zhì)量濃度為1.23×10－2mg/mL，定量限質(zhì)量濃度為3.10×10－2mg/mL。在線性范圍0.147～3.675 mg/mL內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；重復測試計算L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量RSD為0.044%。標準測試溶液在放置72 h內(nèi)測定，L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量RSD僅為0.061%，而樣品溶液中L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量RSD為0.074%。平均回收率達到99.8%。結(jié)果表明該色譜法測定乳酸鋅中L-乳酸鋅含量檢測限與定量限低，重復性和穩(wěn)定性好，回收率高，可用于L-乳酸鋅的準確測定和品質(zhì)監(jiān)控。

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Methodology Validation for Determination of L-Zinc Lactate by High Performance Liquid Chromatography with A Chiral Column

HE Yueming1， WANG Shan2， JIE Qinfeng2， QIU Weihua2， HUANG Xiaowan1， DENG Zeyuan1，*
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang Universit y， Nanchang 330047， China；2. Center for Disease Control and Prevention of Jiangxi Province， Nanchang 330029， China）

This paper describes the development of a validated method for determining L-zinc lactate by high performance liquid chromatography （HPLC）. An ideal chromatographic separation between D-zinc lactate and L-zinc lactate was achieved on an OA-5000 chiral column using 1 mmol/L CuSO4·5H2O as mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The established calibration curve showed a good linearity over the concentration range of 0.147 to 3.675 mg/mL， with a correlation coefficient of 0.999 9 （n = 6）. The relative standard deviation （RSD） for precision and stability were respectively 0.044% was and 0.061%， and the average recovery was （99.8 ± 1.90）% with RSD of 1.90%. It is shown that this method is simple，accurate and reliable， and can be used to monitor the content of L-zinc lactate.

high performance liquid chromatography （HPLC）； L-zinc lactate； chirality

TS202.3

A

1002-6630（2015）14-0107-04

10.7506/spkx1002-6630-201514021

2014-11-16

2013年食品安全國家標準制定項目（spaq-2013-25）

何悅銘（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：he_yue_ming1992@163.com

鄧澤元（1963—），男，教授，博士，研究方向為營養(yǎng)與功能食品。E-mail：dengzy@ncu.edu.cn