牦牛肌原纖維蛋白與熱改性大豆分離蛋白共凝膠條件的優化

孔杭如，孫　莎，唐善虎，閆利國，李思寧，王　柳

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

牦牛肌原纖維蛋白與熱改性大豆分離蛋白共凝膠條件的優化

孔杭如，孫莎，唐善虎*，閆利國，李思寧，王柳

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

牦牛肉是純天然食品原料，然而牦牛肉蛋白資源的開發利用不夠，特別是利用質構重組技術將牦牛肉中的肌原纖維蛋白和大豆分離蛋白用于開發凝膠產品鮮見研究報道。本研究以牦牛肌原纖維蛋白（myofi brillar protein isolate，MPI）與熱改性大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）為原料，分別采用單因素試驗和正交試驗設計，研究SPI-MPI溶液體積比、SPI熱改性溫度、離子強度和轉谷氨酰胺酶（TGase）用量對共凝膠硬度、彈性和持水性的影響。單因素試驗結果表明：改變4 個因素條件均能顯著地提高熱改性SPI-MPI溶液的凝膠性能，各因素對共凝膠特性綜合指標影響的主次順序為SPI-MPI溶液體積比＞TG用量＞離子強度＞SPI熱改性溫度。正交試驗結果表明形成共凝膠的最優條件是：SPI-MPI溶液體積比1∶9、SPI熱改性溫度100 ℃、TG用量50 U/g、不添加鎂離子。

大豆分離蛋白；牦牛；肌原纖維蛋白；凝膠

牦牛肉蛋白質含量高（21%～22%），脂肪含量低（2%～3%），并含有豐富的必需氨基酸、多種多不飽和脂肪酸和維生素，是營養豐富的肉中精品。牦牛肉也因為具有綠色天然、高蛋白、低脂肪等優點，能夠獨立占有市場，并成為消費者真正意義上優質的肉食品［1］。然而，有關牦牛肉蛋白資源的利用和開發的研究幾乎未見報道，特別是缺少利用質構重組技術研發新型牦牛肉蛋白產品研究。大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）具有特殊的功能特性和較高的營養價值，在肉制品加工中可作為功能成分添加到碎肉制品和乳化肉制品中［2］。Matulis等［3］曾報道，在frankfurter香腸中添加3% SPI替代肉蛋白可以增加肌肉凝膠的硬度。研究［4］表明，SPI的凝膠性與其結構有密切的關系，熱處理能使蛋白質分子變性和聚集，在合適的蛋白質質量濃度條件下，會形成自我支撐的凝膠。由于SPI對改善肉制品色、香、味、組織結構及營養價值等品質具有重要的作用，通過在牦牛肉蛋白中合理添加SPI，有可能獲得低成本、高品質和營養平衡的牦牛肉制品。

那治國等［5］利用熱改性大豆分離蛋白和去酰胺改性大豆分離蛋白研究了豬肌肉鹽溶蛋白共凝膠特性的影響，發現熱改性大豆分離蛋白的添加對共凝膠的形成具有一定的抑制作用，而去酰胺改性大豆分離蛋白的添加能夠提高共凝膠的硬度。也有研究［6］表明，大豆分離蛋白經過熱變性后大大提高了肌纖維蛋白凝膠的強度和彈性，而未經加熱的大豆分離蛋白卻對凝膠起到負面作用。歐陽艷華等［7］研究了雞肉肌原纖維蛋白（myofi brillar protein isolate，MPI）和SPI在轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）催化條件下的相互作用及經酶改性后的蛋白質的凝膠性和乳化性，結果表明：酶能催化雞肉蛋白和大豆蛋白發生共價交聯反應，能明顯改善MPI-SPI混合蛋白的凝膠性和乳化性。彭增起等［8］研究了Mg2+作用下雞腿肉凝膠的保水性，發現Mg2+對改善凝膠的保水性有較大的影響。目前為止，尚未見有將牦牛肉中的肌原纖維蛋白和大豆分離蛋白用于開發凝膠產品的報道。本研究旨在以牦牛肉和大豆分離蛋白為原料，通過研究不同因素對熱改性SPI與牦牛肉MPI共凝膠的影響，確定SPI與MPI成膠的最佳條件，為開發新型牦牛肉蛋白產品提供基礎的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

選取自然放牧狀態下，健康無病的3 歲齡牦牛，屠宰后現場采集背最長肌，裝入潔凈保鮮袋中密封，放入－18 ℃冰箱急凍2 h，在0～4 ℃條件下運往實驗室，凍藏。

SPI（蛋白質含量為87.6%） 鄭州誠旺化工食品添加劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、硼酸、濃鹽酸（均為分析純） 成都萇鉦化玻試劑有限公司；TG（活力80 U/g） 泰興市東圣食品科技有限公司。

1.2儀器與設備

TA-XT plus質構儀 英國Stable Micro System公司；BCD-221TMBA冰箱 青島海爾股份有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；FSH-2A可調高速組織勻漿機 金壇市華城海龍實驗儀器廠；PL303分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司；MP511 Lab pH計 上海三信儀表廠；Scino DT208消化單元、Kjeltec 2200自動凱氏定氮儀 瑞士Foss公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1牦牛肉中MPI的提取

MPI是肌肉中最重要的蛋白，占肌肉蛋白質總量的40%～60%［9-10］。牦牛肉中MPI提取參照Xiong等［11］方法并略作修改。取凍藏牦牛肉（背最長肌）300 g，室溫經過6 h自然解凍，剔除脂肪和結締組織，切成2 mm大小的肉粒，加入4 倍體積的磷酸緩沖溶液（0.1 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、0.05 mol/L Na2HPO4，pH 7.0），在高速組織勻漿機里高速勻漿60 s，2 000×g、4 ℃離心15 min，倒掉上清液，取沉淀，重復3 次。將經過3 次提取的沉淀與4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液混合，高速勻漿30 s，2 000×g、4 ℃離心15 min，倒掉上清液，將沉淀與8 倍體積的0.1 mol/L NaCl混合勻漿，四層紗布過濾，調整濾液的pH值為6.25，在4 ℃使用2 000×g離心15 min，棄去上清液，即為MPI。最后得到的蛋白膏保存于冰盒中備用，保存24 h。采用凱氏定氮法測得MPI含量為12%，提取流程見圖1。

圖1　牦牛肉MPI提取流程Fig.1　Extraction procedure for myofibrillar protein from yak meat

1.3.2SPI的熱改性

將SPI溶于蒸餾水中，制備成4%（m/m，pH 7.0）的SPI溶液，加熱，待中心溫度分別升至80、90、100 ℃時，保溫5 min后冷卻至室溫，備用。

1.3.3凝膠的制備

將牦牛MPI與緩沖溶液混合，采用稀釋的方法和凱氏定氮的方法調整蛋白質質量分數約4%、Na2HPO4濃度50 mmol/L、NaCl濃度0.6 mol/L、pH 5.6。將配制好的牦牛MPI溶液與熱改性SPI溶液按照正交設計表進行不同體積比混合，將混合溶液倒入內徑2 cm、高5 cm的玻璃管中，使液面高度為25 mm，加入MgCl2溶液以及TG。將蛋白溶液放入4 ℃冰箱2 h，然后取出振蕩除去氣泡，20 ℃水浴鍋中加熱，以1.5 ℃/min的速率升溫，待玻璃管內中心溫度為80 ℃時停止加熱，迅速置于冰浴中冷卻到4 ℃，在4 ℃冰箱中存放12 h，使用前將凝膠試樣取出，25 ℃放置1 h，待測。

1.3.4單因素試驗

1.3.4.1SPI-MPI溶液體積比對凝膠特性的影響

將MPI溶液與SPI溶液按體積比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8的比例混合成總粗蛋白含量為4%的混合蛋白溶液，且設置對照組，對照組均為牦牛MPI溶液，調節pH值為6.0，在20 ℃水浴中平衡10 min，以1.5～2 ℃/min的速率加熱至80 ℃，保持20 min，取出冰浴冷卻，然后在4 ℃放置過夜，每組設置3 個重復。分別測定凝膠的硬度、彈性及持水性并求出平均值。

1.3.4.2SPI熱改性溫度對凝膠特性的影響

將SPI溶液分別加熱到50、60、70、80、90、100 ℃，與MPI溶液以2∶8的體積比混合成總粗蛋白含量為4%的混合蛋白溶液，調節pH值為6.0，在20 ℃水浴中平衡10 min，以1.5～2 ℃/min的速率加熱至80 ℃，保持20 min，取出冰浴冷卻，然后在4 ℃放置過夜，每組設置3個重復。分別測定凝膠的硬度、彈性及持水性并求出平均值。

1.3.4.3離子強度對凝膠特性的影響

將熱改性溫度為90 ℃的SPI溶液與MPI溶液以2∶8的體積比混合成總粗蛋白含量為4%的混合蛋白溶液，依次加入0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mol/L氯化鎂溶液，調節pH值為6.0，在20 ℃水浴中平衡10 min，以1.5～2 ℃/min的速率加熱至80 ℃，保持20 min，取出冰浴冷卻，然后在4 ℃放置過夜，每組設置3 個重復。分別測定凝膠的硬度、彈性及持水性并求出平均值。

1.3.4.4TG用量對凝膠特性的影響

將熱改性溫度為90 ℃的SPI溶液與MPI溶液以2∶8的比例混合成總粗蛋白含量為4%的混合蛋白溶液，依次加入TG 0、10、30、50、70、90 U/g，調節pH值為6.0，在20 ℃水浴中平衡10 min，以1.5～2 ℃/min的速率加熱至80 ℃，保持20 min，取出冰浴冷卻，然后在4 ℃放置過夜，每組設置3個重復。分別測定凝膠的硬度、彈性及持水性并求出平均值。

1.3.5各因素對凝膠特性影響的正交試驗

根據賀江航［12］、王苑［13］等研究結論及單因素試驗結果，選取對凝膠形成影響較大的因素：SPI-MPI溶液體積比、SPI熱改性溫度、離子強度和TG添加量，選用L9（34）正交試驗設計，研究這4 個因素對共凝膠體系凝膠的硬度、彈性及持水性的影響。正交試驗因素水平設置見表1。

表1　正交試驗因素與水平表Tab1el　Factors and coded levels for orthogonal array design

1.3.6蛋白凝膠指標的測定

1.3.6.1蛋白凝膠硬度和彈性的測定

凝膠硬度和彈性測定方法參照Xiong等［14］的方法。將凝膠從冰箱中取出，室溫條件下放置1 h，將待測樣品置于測定平臺上固定好，室溫條件下使用TA-XT plus質構儀測定制備的蛋白凝膠。以質構剖面分析（texture profi le analyser，TPA）方法測定凝膠的硬度和彈性。

質構儀主要參數：探頭類型為P/0.5，物性儀重力傳感器選擇5 kg，測前速率2.0 mm/s，測定速率1 mm/s，測定距離5.0 mm，測后速率2.0 mm/s，觸發類型為自動，觸發力5 g，數據采集率200 pps。

1.3.6.2蛋白凝膠持水性的測定

將4 ℃過夜后的凝膠（約5 g，M1）移至50 mL的離心管中并記總質量（M2），離心（10 000×g，15 min，4 ℃）。倒掉離出的水，將含有樣品的離心管倒置于鋪有吸水紙巾的桌面上，15 min后稱質量（M3）［15］。蛋白凝膠持水性計算公式如下：

1.4數據處理

所有實驗處理均設置至少3 次重復，數據經PASW Statistics 18軟件進行方差分析，并用Duncan法進行多重比較分析。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1SPI-MPI溶液體積比對共凝膠硬度、彈性及持水性的影響

圖2　蛋白混合比例對共凝膠硬度、彈性及持水性的影響Fig.2 Effects of SPI/MPI ratio on the hardness， springiness and water-holding capacity of SPI-MPI gel

由圖2可知，隨著SPI-MPI溶液中SPI比例的增大，共凝膠的硬度呈下降趨勢；SPI-MPI共凝膠的彈性呈先下降后上升再下降再上升再下降的趨勢；SPI-MPI共凝膠的持水性呈先上升后下降再上升再下降再上升的趨勢。由顯著性分析可知，改變SPI-MPI溶液混合蛋白的比例對共凝膠的硬度彈性及持水性有不同程度的影響：對共凝膠的硬度及持水性有顯著的影響（P＜0.05），對共凝膠的彈性影響較小（P＞0.05）。

2.1.2TG用量對共凝膠硬度、彈性及持水性的影響

圖3　TG用量對共凝膠硬度、彈性及持水性的影響Fig.3 Effects of TGase concentration on the hardness， springiness and water-holding capacity of SPI-MPI gel

由圖3可知，隨著TG用量的增大，SPI-MPI共凝膠的硬度呈先上升后下降再上升的趨勢；SPI-MPI共凝膠的彈性呈先上升后下降再上升的趨勢，幅度不明顯；SPI-MPI共凝膠的持水性呈一直緩慢上升的趨勢。當TG用量為50 U/g時，SPI-MPI共凝膠的硬度具有突躍性的上升，之后趨于平緩。由方差分析可得，改變TG用量對共凝膠的硬度彈性及持水性有不同程度的影響：對SPI-MPI共凝膠的硬度有顯著的影響（P＜0.05），對彈性及持水性的影響較小（P＞0.05）。

2.1.3離子強度對凝膠硬度、彈性及持水性的影響

圖4　離子強度對凝膠硬度、彈性及持水性的影響Fig.4　Effects of ion concentration on the hardness，springiness and water-holding capacity of SPI-MPI gel

由圖4可知，隨著離子強度的升高，SPI-MPI共凝膠的硬度呈先上升再下降再上升再下降的趨勢；SPI-MPI共凝膠的彈性呈先上升后下降，最后趨于平緩的趨勢；SPI-MPI共凝膠的持水性呈先上升再下降再上升再下降的趨勢。當離子強度是0.07 mol/L時，SPI-MPI共凝膠的硬度達到最大值，為90.332g。當離子強度是0.03mol/L時，SPI-MPI共凝膠的彈性及持水性達到最大值，分別為1.067、0.590。分析圖4可得，改變離子強度對SPI-MPI共凝膠的硬度及彈性有顯著的影響（P＜0.05），對持水性的影響較小（P＞0.05）。

2.1.4SPI熱改性溫度對凝膠硬度、彈性及持水性的影響

圖5　SPI熱改性溫度對凝膠硬度、彈性及持水性的影響Fig.5　Effects of SPI heating temperature on the hardness springiness and water-holding capacity of SPI-MPI gel

由圖5可知，隨著SPI熱改性溫度的升高，SPI-MPI共凝膠的硬度呈先上升再下降再上升再下降的趨勢；SPIMPI共凝膠的彈性呈先下降再上升再下降的趨勢；SPIMPI共凝膠的持水性呈先下降再上升再下降再上升的趨勢。當SPI熱改性溫度為60 ℃時，共凝膠的硬度和彈性達到最大值，分別為88.419g、0.948。分析圖5可得，改變SPI熱改性溫度對SPI-MPI共凝膠的硬度彈性及持水性的影響其他3 個因素不顯著（P＞0.05）。

2.2共凝膠形成條件正交優化試驗結果

表2　不同正交組合處理對凝膠硬度、彈性和持水性影響Table2　Orthogonal array design with experimental values of hardness， elasticity and water-holding capacityy

由表2極差分析可以看出，各因素對于硬度指標的影響順序是A＞D＞C＞B，彈性指標是D＞B＞C＞A，持水性指標是A＞C＞D＞B。凝膠硬度的最優組合為A1B3C3D3，彈性的最優組合為A1B3C2D1，持水性的最優組合為A1B1C1D3。

2.3正交試驗各因素趨勢圖分析

圖6　正交各因素趨勢圖Fig.6　Trend charts for the effects of four factors on gel hardness，water-holding capacity and springiness

由圖6可知，在SPI-MPI溶液體積比為1∶9時，凝膠的硬度、彈性和持水性均為最大值，分別是139.071g、0.937、0.537。凝膠硬度和持水性的整體趨勢是硬度不斷下降，持水性不斷下降。而彈性呈先下降后上升的趨勢。綜上分析，試驗水平應選擇SPI-MPI溶液體積比為1∶9，即A1。這與那治國等［5］報道的添加比例相同，可以看出MPI所占比例越大，越有助于凝膠的形成。

當SPI熱改性溫度為100 ℃時，凝膠的硬度和彈性達到最大值，分別為101.325g和0.961，且SPI熱改性溫度對凝膠的持水性有較大的影響。熱改性溫度對于持水性的影響不大，曲線變化幅度趨于平緩。綜上所述，試驗水平應選擇SPI熱改性溫度為100 ℃，即B3。王苑［13］報道了類似的溫度。

隨著離子強度的增加，凝膠的持水性不斷下降，硬度不斷增大，彈性先上升后下降，當離子強度為0時，持水性最大，為0.515。當離子強度為0.03 mol/L時，硬度較大，彈性達到最大值，為0.942。但各水平之間相差不大，差異不顯著（P＞0.05）。綜上所述，僅從此圖分析可得，試驗水平應選擇離子強度為0，即C1。有報道［13］表明低濃度的MgCl2（0.01～0.02 mol/L）對混合凝膠有影響，降低了凝膠的硬度，但是與未添加MgCl2的混合蛋白凝膠無顯著差異（P＞0.05）。

當TG用量為50 U/g時，凝膠的硬度最大達到117.258g，與祖海珍等［16］研究的酶活濃度相差5 倍，這可能是由于各因素之間相互作用及樣本測定方法不同導致的。當TG用量為10 U/g時，有最小值，但TG用量為50 U/g和0 U/g時的彈性區別不大。綜上所述，為有良好的凝膠特性，應該選擇試驗的水平為50 U/g。當TG用量為50 U/g時，持水性最大，為0.500，與之前的研究的酶用量一致［16］。

2.4各因素水平多重比較分析結果

采用最小顯著差數法對A、B、C、D單個因素條件下各水平進行多重比較分析，其結果見表3。

表3　同一因素各水平之間多重比較分析結果Table3　Multiple comparison analysis of each factor at different levels

硬度是凝膠能否形成的決定性因素，也是消費者最首先直觀感受到的，因此，選擇將凝膠硬度作為第一評價指標；彈性在凝膠中起重要的作用，是消費者重視的食用品質，將其作為第二評價指標。由表3中A因素3 個水平多重比較結果可知，隨著SPI添加比例的增大，凝膠彈性降低，因為在相同蛋白質量分數條件下，SPI形成凝膠的能力遠不如MPI的成膠能力。當混合蛋白體系中SPI添加量越多時，MPI也被稀釋到越低的質量分數，削弱了成膠蛋白間的相互作用，所形成的凝膠網絡結構強度越低［17］；在相關水平之間，凝膠硬度、持水性存在顯著差異（P＜0.05），但A因素對凝膠彈性影響不顯著，綜合3 個評價指標，選擇A1水平。

B因素對凝膠持水性影響不顯著（P＞0.05），隨著熱改性溫度的升高，凝膠硬度增大，差異不顯著（P＞0.05），但100 ℃熱改性溫度的凝膠彈性顯著增大（P＜0.05）。這是因為大豆蛋白中的7S和11S的變性溫度分別在75 ℃和90 ℃［18-19］，而在100 ℃條件下，大豆蛋白已經發生變性，并且部分變性甚至完全變性的SPI能夠參與到MPI的膠凝作用中，并對混合凝膠的彈性有顯著影響|（P＜0.05）。因此選擇100 ℃熱改性的SPI，即B3水平。

離子強度能夠影響MPI的溶解能力，因此對凝膠特性有著重要的影響［20］添加MgCl2可以提高凝膠的硬度，且隨著離子強度的增大凝膠硬度隨之增大，但是差異并不顯著（P＞0.05），且不添加MgCl2的凝膠硬度在可接受范圍之內。使用0.03 mol/L MgCl2提高了凝膠的彈性，0.05 mol/L MgCl2破壞了凝膠的彈性，它們之間差異不顯著（P＞0.05）。隨著MgCl2濃度的升高，凝膠持水性下降，差異也不顯著（P＞0.05）。在高鹽濃度條件下，Mg2+并沒能顯著改善混合凝膠的相關特性，可能是由于電負性過強，導致蛋白質之間鹽橋的形成，降低了蛋白質之間的相互作用［21］。綜合考慮MgCl2對凝膠硬度、彈性及持水性的影響，選擇在凝膠中不添加MgCl2。

TG促進肽內或肽之間的肽鍵形成，催化蛋白的交鏈形成網狀結構［22］。Dondero等［23］指出添加質量分數0.5%TG的牛肉蛋白，在經2 h、60 ℃加熱后，其凝膠抗斷裂強度比對照組高88%。在試驗水平范圍內，隨著TG用量的增加凝膠硬度和持水性上升，但當TG用量為10 U/g時，凝膠彈性明顯下降（P＜0.05）；當TG用量為50 U/g時，彈性又上升。江波等［24］證明了TG可催化肌球蛋白分子和大豆蛋白分子之間的共價交聯，增加蛋白質凝膠結構的強度。由于TG是產生黏著的混合凝膠結構的較好的添加劑［25］，結合硬度指標，TG的添加量選擇D3水平。

綜合凝膠形成最佳條件及經濟效益考慮：牦牛MPI與熱改性SPI共凝膠的最優條件組合為A1B3C1D3，即熱改性SPI溶液與牦牛MPI溶液體積比1∶9、SPI熱改性溫度100 ℃、不添加Mg2+、TG用量50 U/g。

3　結 論

本實驗研究SPI-MPI溶液體積比、SPI熱改性溫度、離子強度以及TG用量這4 個因素對SPI-MPI溶液形成共凝膠的影響，各因素對共凝膠特性綜合指標影響的主次順序為熱改性SPI-MPI溶液體積比＞TG用量＞離子強度＞SPI熱改性溫度。綜合分析試驗結果可知，熱改性SPI與牦牛MPI共凝膠的最優組合為A1B3C1D3，即熱改性SPI溶液與牦牛MPI溶液體積比1∶9、SPI熱改性溫度100 ℃、Mg2+添加量0、TG用量50 U/g。

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Optimization of Co-Gelation Conditions of Yak Myofibrillar Protein and Heat Modified Soy Protein Isolate

KONG Hangru， SUN Sha， TANG Shanhu*， YAN Liguo， LI Sining， WANG Liu
（College of Life Science and Technology， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China）

Yak meat has not yet been fully exploited as an excellent source of natural protein， especially yak myofi brillar the combined application of which with soy protein isolate （SPI） in gel products by texture and structure recombination has not yet been reported. The objectives of this study were to investigate the effects of myofi brillar protein isolate （MPI）/SPI ratio， heating temperature of SPI， ion concentration， and transglutaminase （TGase） concentration on co-gelation properties and consequently to obtain the optimized gelation conditions for MPI and SPI. All the four factors had a significant positive on gelation properties of thermally modifi ed SPI and MPI in the decreasing order of SPI/MPI ratio （by volume） ＞TG concentration ＞ ion concentration ＞ heating temperature of SPI. Using an orthogonal array design， the optimal cogelation conditions were determined as follows： SPI/MPI ratio， 1：9； heat modifi cation temperature for SPI， 100 ℃； TGase concentration， 50 U/g； and no added magnesium.

soy protein isolate； yak； myofi brillar protein； gel

TS251.1

A

1002-6630（2015）14-0044-06

10.7506/spkx1002-6630-201514009

2014-11-26

四川省重大科技專項（2012NZ0047）；四川省科技支撐計劃項目（2014NZ0052）

孔杭如（1995—），女，本科生，研究方向為食品科學。E-mail：konghangru@sina.cn

唐善虎（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品科學和食品安全。E-mail：stang01@126.com