不同制備工藝對雙黃連口服液有效成分含量及藥效的影響

王　彬，韓　露，付文力，李靈娟，柴保國

（1.河南牧翔動物藥業有限公司，河南 鄭州　451162；2.河南省畜牧總站）

不同制備工藝對雙黃連口服液有效成分含量及藥效的影響

王彬1*，韓露2，付文力1，李靈娟1，柴保國1

（1.河南牧翔動物藥業有限公司，河南 鄭州451162；2.河南省畜牧總站）

當前家禽養殖實踐中，感冒作為高發性疾病常常給實際生產造成巨大損失，嚴重危害養禽業健康，已經成為影響當前家禽生產效益的主要疾病之一。感冒類疾病通常分為兩類：一類為因季節交替、冷熱交替、免疫應激等非傳染性因素引起雞群發病導致的普通感冒，以甩鼻、呼嚕癥狀為主，若表證不除，郁而化熱感染外邪則會發展成流行性感冒（風熱感冒），并進一步導致復合感染，造成其他臟器損傷；另一類為因新城疫及傳支病毒等傳染性因素引起的發熱、咳嗽、呼吸困難等流行性感冒類，患禽主要表現為低死亡率和輕度的呼吸道感染或產蛋率下降等臨床癥候群，全身器官病變迅速且嚴重，尤其是心、肺、腎等臟器，免疫系統也遭到破壞，繼發細菌感染后易致病程延長，甚至出現高死淘現象。

雙黃連口服液源于《石室密錄》載方連翹湯，早在戰爭年代，人醫上已用于治療流感、感冒及多種感染病癥；現代藥理證實，該藥具有抗病毒、抗菌、解熱抗炎、提升機體免疫力等多靶點綜合治療作用，是人醫及獸醫臨床用于防治感冒及上呼吸道感染的代表性中成藥之一。酶解法制備雙黃連系《中華人民共和國獸藥典（2010年版二部）》傳統工藝基礎上創新應用酶解法專利制備工藝（公開號：CN103520284A、CN102895317A）制得的雙黃連口服液。該文主要從不同制備工藝對雙黃連口服液藥效學影響角度，對通過酶解工藝制備雙黃連口服液在家禽感冒、免疫應激方面的防治效果方面進行研究。

1　材料

1.1藥物

黃芩、金銀花、連翹藥材，購于鄭州市張仲景大藥房，經檢驗均符合《中華人民共和國獸藥典（2010年版二部）》質量標準；提取用鹽酸、氫氧化鈉、乙醇均為分析純，購自深圳某公司；生物酶由上海某公司提供Celluclast（纖維素酶）CC102025，活性度為20 000 U/g，

Pentopan Mono BG（木聚糖酶）CF102399，活性度為30 000 U/g；雙黃連口服液（250毫升/瓶），某公司生產（酶 解 法 制備，批號 13060107H、13070507H、13100207H、14060108H）。

1.2試劑

黃芩苷對照品（批號：110715-201215），黃芩素對照品（批號：111595-201005），綠原酸對照品（批號：110753-201314），咖啡酸對照品（批號：110885-201302）木犀草素對照品（批號：111520-201309）連翹苷對照品（批號：110821-201211），以上標準品均購自中國藥品生物制品檢定所；其他試劑均為色譜純。

1.3儀器

島津LC-10ATvp高效液相色譜儀；SPD-10Avp紫外可見檢測器；CLSS-VP色譜工作站；CTO-10ASvp柱溫箱；7725i手動進樣器；中藥提取設備；管式離心機；中空纖維濾膜；中藥濃縮罐，均為湖南某醫藥設備有限公司。

2　試驗方法

2.1雙黃連口服液不同提取工藝樣品制備

處方：黃芩900 g、金銀花900 g、連翹1 800 g，最終制備成2 400 ml藥液。

水提醇沉法（簡稱水醇法，下同）：稱取以上同批次3種生藥，按現有2010版獸藥典二部中所示加水煎煮、醇沉洗脫、濃縮過濾、灌裝滅菌等工藝流程進行制備，樣品保留3個重復；酶解-三級復合物理除雜法（簡稱酶解法，下同）：稱取以上同批次3種生藥，按照授權發明專利（公開號：CN103520284A、CN102895317A）進行加水煎煮、酶解（纖維素酶、木聚糖酶）、滅酶、三級物理除雜、濃縮過濾、灌裝滅菌等工藝流程制備的雙黃連口服液，樣品保留3個重復。

2.2色譜條件

采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，以乙腈（A）-1%冰醋酸溶液（B）為流動相梯度洗脫∶15%A（0 min），25%A（15 min），30%A（20 min），40%A（25 min），40%A（35 min），60%A（45min），檢測波長為280 nm，參比波長：380 nm，流速為1.0 ml/min，進樣量為10μl，柱溫為30℃。理論板數不低于10 000。

2.3溶液的制備

2.3.1供試品溶液的制備精密稱取不同制備工藝的雙黃連口服液樣品各2.0 ml，分別加50%甲醇25 ml，超聲處理30 min，過濾，即得。

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取黃芩苷、黃芩素、綠原酸、咖啡酸、木犀草素、連翹苷對照品制成混合對照品溶液（濃度為黃芩苷1.06 mg·ml-1，黃芩素0.083 mg·ml-1，綠原酸0.26 mg·ml-1，咖啡酸0.080 mg·ml-1，木犀草素0.065 mg·ml-1，連翹苷0.13 mg·ml-1）。

2.3.3空白溶液制備取溶劑50%甲醇25 ml，按“3.3.1”項下方法制成空白對照溶液。

2.4不同制備工藝對雙黃連口服液藥效作用的影響

2.4.1風熱感冒治療

德惠市南郊某肉雞自養場，大肉食肉雞，3棟雞舍，每棟10 000只。18日齡時3棟雞舍大群均出現發病癥狀，癥見發病雞表現體溫升高，精神沉郁，羽毛松亂，頭頸卷縮，冠及肉髯發紺，眼瞼水腫，結膜發炎。采食量減少或急驟下降，排黃白綠色稀便。呼吸困難，有啰音，咳嗽、打噴嚏，張口呼吸，鼻孔流出黏性鼻液，剖檢發現呼吸道尤其是鼻竇，出現炎癥，氣管黏膜充血，每棟雞舍發病情況大致類似，駐場獸醫診斷為風熱感冒。將3棟雞

舍隨機分為3組，分別按照表1所示用藥方式進行用藥，對試驗雞只按照以下療效評價標準（見表后），進行評價打分，并統計試驗結果，采用SPSS13.0進行單因素方差分析。

表1　風熱感冒臨床試驗各組及用藥情況

治愈率：在用藥5 d內，經用藥后臨床癥狀基本消失，精神和采食情況恢復正常者，判定為治愈；每組治愈雞只數占每組試驗雞只數的百分率為治愈率。

顯效率：除完全治愈的雞只為有效外，凡試驗期間未死亡，并且癥狀明顯減輕，糞便、精神有所好轉，飲水和食欲趨于正常者也視為有效；每組存活且治療有效的雞只數占每組試驗雞只數的百分比為有效率。

死亡率：凡在試驗期間死亡，剖檢有特征性病變者判為死亡；死亡雞只數占每組試驗雞只數的百分率為死亡率。

2.4.2免疫應激引起的普通感冒預防

山東章丘某商品蛋雞自養場，6棟雞舍，每棟5 000只，220日齡海蘭褐開產蛋雞，隨機選取同朝向3棟雞舍分為3組，防疫前5 d使用藥物，按照標準化蛋雞防疫流程進行防疫（200～220 d，新城疫-H9二聯油苗0.5毫升/只頸部或胸部皮下注射），各組藥物3 d一個療程，觀察各組預防家禽疫苗免疫應激產生呼吸道效果，并依據上述療效評價標準進行結果統計。

通常應激反應有甩頭、流淚、打噴嚏、呼嚕、咳嗽等癥狀，這種反應在免疫接種2 d出現，之后一周內反應較重，以后逐漸減輕，有的會出現精神不振、采食減少、排綠色糞便等現象，嚴重的會引起死亡。依據臨床用藥程序，按照表2所示三組不同用藥方式進行用藥。

表2　預防免疫應激感冒試驗分組情況

3　結果與討論

3.1不同提取工藝對雙黃連口服液活性成分收率的影響

現代研究證實，雙黃連口服液主要藥效成分除了黃芩苷、綠原酸、連翹苷外尚有黃芩素、木犀草素等多種活性成分，傳統水醇法制備方法存在工藝成本較高、活性成分損失率高、操作周期長等缺點，通過試驗測定結果可以看出，該試驗通過創新應用專利酶解-物理除雜技術，運用復合酶高效、專性裂解細胞壁的特性并有機融合三級復合物理除雜工藝，使酶解法制備雙黃連口服液6種主要活性成分收率較傳統水醇法提升幅度在30%左右，其中，黃芩苷、綠原酸含量極顯著高于常規提取工藝（P<0.01），連翹苷等其余成分也顯著高于常規含量（P<0.05），能明顯提升雙黃連口服液產品品質。如表3所示。

3.2不同制備工藝對雙黃連口服液藥效作用的影響

3.2.1風熱感冒治療

從表4試驗結果可以看出：酶解法雙黃連樣品配合治療風熱感冒防治效果優于水醇法樣品和對照治療組，這可能與生物酶法提取的雙黃連所含黃芩苷、連翹苷、黃芩素、木犀草素等抗感染活性成分含量高，能夠更有效的抑殺病毒、細菌等病原，提高機體免疫力及抗病能力，從而使機體抗病能力更強，治愈率更高，具體作用機制有待進一步研究。

表3　不同雙黃連制備工藝有效成分含量比較　　單位：mg·ml-1

表4　各組防治風熱感冒臨床試驗結果

3.2.2免疫應激引起的普通感冒預防

根據試驗結果統計（詳見表5），酶解法制備雙黃連組防疫后第4天才有個別雞只產生呼吸道癥狀，發生比率估測在2%以內，優于水醇法組（防疫后4天呼吸道癥狀發病率5%左右），空白對照組第2天即產生疫苗應激反應，發生比率在7%～10%之間，初步臨床試驗說明酶解法制備雙黃連組效果優于水醇法。

表5　各組預防免疫應激性普通感冒臨床試驗結果

3.3小結

中藥酶解提取技術是利用酶反應高度專一的酶來降解植物細胞壁，從而提高有效成分的溶出率，試驗結果證明，通過生物酶解法提取口服液6種主要活性成分比傳統水醇法活性成分收率要提高30%左右，二者具有顯著差異。進一步通過臨床對家禽風熱感冒及免疫應激性普通感冒的試驗比較，證實了酶解法提取的雙黃連口服液臨床治療效果要明顯優于水醇法雙黃連口服液，且對風熱感冒治愈率能夠達到接近90%左右，具有一定的臨床應用優勢。同時，新工藝顯著增加黃芩苷、綠原酸、木犀草素等抗感染活性成分提取率，上述結果說明，酶解法制備雙黃連口服液可能是通過有效抗感染活性成分收率提升增加對風熱感冒等治愈率。

4　討論

現代藥理學研究及臨床實踐證明，雙黃連口服液中的黃芩具有清肺熱、解肌表之熱的功效，而金銀花配合連翹具有辛涼解表之功效，其解熱的機理就是作用于體溫調節中樞，使機體產熱量減少，體溫下降；金銀花活性成分能夠抑制耐藥菌蛋白質合成，阻斷病原體的代謝和繁殖，從而抑制和殺滅病原微生物，黃芩苷具有抑制病毒復制的功能，從而阻斷病毒的增殖，起到抗病毒的作用，連翹中的金絲桃素同樣也具有抗病毒的作用，其抗病毒機制為阻斷蛋白質和核酸的合成；大量研究證實，雙黃連可促進溶血素的生成，對機體的免疫有增強作用，主要是增強T淋巴細胞的增殖，提高細胞免疫，此外還能夠提高淋巴細胞的轉化率，增強補體效價從而增強機體的免疫力。

免疫應激是非常復雜的生理反應，涉及到免疫、神經和內分泌等系統。一般認為機體主要通過下丘腦一垂體-腎上腺軸（HPA）系統參與調節應激反應，糖皮質激素是HPA軸的最終產物，由腎上腺皮質束狀帶分泌的主要有皮質酮、皮質醇等，對免疫系統具有廣泛的作用。機體參與調節應激反應的途徑除HPA軸外，還需要垂體-甲狀腺系統參與。在免疫應激狀態下，可能由于機體內腎上腺皮質激素和甲狀腺素升高，使機體的細胞免疫功能受到抑制，機體更易受到外源感染威脅，引起感冒發熱、咳嗽等病癥。現代藥理研究證實，雙黃連所含苷元（黃芩黃酮、連翹酯苷）成分能夠緩解家禽細胞及體液免疫抑制，激活補體系統，提升機體免疫力，這可能也是雙黃連能夠預防通風不良、忽冷忽熱以及免疫應激等所致的普通感冒的作用機制之一。

雙黃連口服液是目前市場認知度較高的獸用抗感染產品，其抗病毒、抗菌、解熱抗炎方面多效藥理作用的發揮有賴于主要活性成分最大限度被提取出來，該試驗研究了新型酶解提取雙黃連工藝，在這方面做了有益嘗試，并在防治家禽感冒病癥方面取得了理想的應用效果。□

王彬（1982-）男，臨床獸醫學碩士，從事中獸醫藥研究，hongyi2012@126.com。