茶葉生產廢料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的純化工藝

許敏等

摘要：分析了茶葉生產廢料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的純化工藝，并采用大孔樹脂對其進行分離純化。結果表明，運用靜態吸附與動態吸附相結合的方法分析得到，適用于茶葉生產廢料中EGCG分離純化用的大孔吸附樹脂為D101。其最佳分離純化條件為：將20.0 mg/mL上柱液以1.5 BV/h上柱4.5 BV，使用20%乙醇以0.5 BV/h洗脫4.0 BV。

關鍵詞：茶葉生產廢料；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）；純化

中圖分類號：S571.1；TS272.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4570-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.045

茶葉是恩施土家族苗族自治州的六大經濟支柱產業之一，在其生產過程中會產生大量的廢料——茶梗、茶末、茶樹修剪枝條等。這些廢料因含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯（以下簡稱EGCG）而極具開發價值[1]。據文獻報道，EGCG具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、免疫調節、對糖尿病腎臟的保護、防輻射等作用，還可以降壓、降脂、降血糖[2-7]。為了綜合開發茶葉資源，促進恩施州茶葉產業鏈的有效延伸，增加當地茶農的收入，采用當地產量大、價格低廉的茶葉生產廢料提取EGCG，并對其提取工藝進行研究，以期更有效地開發利用茶葉廢料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉生產廢料購于恩施市清江生物有限公司。大孔樹脂：D608、 HPD100、 XDA-1、 D302、 D101B、D609、D103、D102、D4020、DM130、D101、D301、X-5及聚酰胺型樹脂（上海摩速科學器材有限公司）。

EGCG標準品（批號：100603，含量≥98%，上海融禾醫藥科技有限公司提供）；水為純化水；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 儀器

DIONEX U3000 高效液相色譜儀（Chromeleon色譜工作站），Acclaim 120 C18 5 μm Analytical （4.6 mm×250 mm）色譜柱，VWD3100檢測器； MS105 半微量天平（感量0.01 mg，METTLER TOLEDO）；AL204 分析天平（感量0.1 mg，METTLER TOLEDO）；LGJ-10凍干機（北京四環科學儀器廠）；KQ-2500超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，33 kHz）；UV2600紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；微孔濾膜（有機系，0.22 μm）。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線繪制 精密稱取EGCG標準品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇溶解制成濃度為0.3 mg/mL的溶液，搖勻，微孔濾膜過濾，取濾液作為標準品溶液。取5、10、15、20、25 μL標準品溶液參照文獻[8]的色譜條件分別測定峰面積，平行測定3次。以進樣量X（μg）為橫坐標軸、峰面積A為縱坐標軸繪制標準曲線，計算其線性回歸方程。

1.3.2 EGCG測定方法 稱取茶葉生產廢料細粉0.2 g，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇超聲提取30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取濾液測定峰面積并帶入回歸方程計算茶葉生產廢料中EGCG的含量。

1.3.3 EGCG提取方法 取茶葉生產廢料粗粉10 g置于索氏提取器中，參照文獻[9]的方法提取2次，趁熱抽濾，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇味，得茶葉生產廢料提取液。

1.3.4 EGCG純化工藝

1）樹脂的篩選。對大孔樹脂進行預處理[10，11]，分別量取預處理好的大孔樹脂10 mL，置250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL已知EGCG濃度的茶葉生產廢料提取液，25 ℃、100 r/min振蕩24 h后取出，測定EGCG吸附量，并計算比吸附量（比吸附量=EGCG吸附量/樹脂體積）；靜態吸附完成后，過濾除去茶葉生產廢料提取液，將樹脂重新置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL 95%乙醇以25 ℃、100 r/min振蕩24 h取出，測定EGCG解吸量，計算解析率（解析率=被解析EGCG量/被吸附EGCG量×100%）。選擇比吸附量大且解析率高的大孔樹脂作為分離純化EGCG的樹脂。

2）吸附條件優化。改變樣品的濃度、上樣速度對吸附條件進行優化[10，11]。分別取60 mL篩選出的樹脂裝入3根玻璃柱，充分沉降均勻，將樣品溶液以一定速度通過樹脂柱，前150 mL流出液不收集，后每15 mL收集1份，分別取5 μL測定EGCG峰面積，繪制曲線圖，確定上樣濃度及上樣速度。根據確定的上樣濃度和上樣速度進行動態吸附，并測定EGCG峰面積，繪制泄露曲線。

3）洗脫條件優化。改變乙醇的體積分數、洗脫流速對洗脫條件進行優化[10，11]。按上述確定的吸附條件上柱，吸附平衡后，用2 BV純化水淋洗樹脂柱，后依次用不同體積分數的乙醇溶液以不同的流速淋洗樹脂柱，各濃度淋洗液的量為3 BV。收集淋洗液，每15 mL收集1份，每份淋洗液取5 μL進行液相色譜儀分析，測定EGCG峰面積，繪制洗脫曲線，考察乙醇體積分數、洗脫流速對洗脫效果的影響。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

線性回歸方程為：A=22.733X-0.5571，r=0.999 8（n=5）。

2.2 含量測定

采用HPLC分析得到茶葉生產廢料中EGCG的含量為82.42 mg/g。

2.3 樹脂的篩選

在篩選的14種樹脂中，多種大孔樹脂對茶葉生產廢料中EGCG的比吸附量都較大，但以D101型樹脂為好，從解析率來看，也以D101型樹脂為最好，故確定D101型樹脂為分離純化茶葉生產廢料提取液中EGCG的最佳樹脂。

2.4 吸附條件優化

2.4.1 上樣濃度 不同上樣濃度的曲線見圖1。從圖1可以看出，上樣濃度對單位樹脂吸附EGCG的量影響不大，但對吸附時間有比較大的影響。在試驗過程中發現，當上樣濃度超過20 mg/mL以后，樣品溶液在上柱過程中易產生沉淀，堵塞樹脂柱，故最終確定上樣濃度為20 mg/mL。

2.4.2 上樣速度 上柱流速為1.0、1.5、2.0 BV/h，當漏出液EGCG峰面積達拐點時，其上柱液體積分別為4.5、4.5、4.2 BV，上柱操作時間分別為270、180、126 min。從試驗過程來看，1.5 BV/h比1.0 BV/h的上樣速度要快得多，但樹脂吸附EGCG總量卻沒有差異，故確定上柱流速為1.5 BV/h。

2.4.3 泄露曲線 泄露曲線見圖2。從圖2可以看出，從第18號收集液開始，EGCG的峰面積急劇增大，說明此時EGCG已經開始明顯泄露，故確定茶葉生產廢料提取物溶液的上柱量為4.5 BV。

2.5 洗脫條件優化

2.5.1 乙醇體積分數 當采用10%的乙醇洗脫時，EGCG很快就被洗脫下來，表兒茶素沒食子酸酯（以下簡稱ECG）卻沒有洗脫出來，隨著時間的推移，EGCG和ECG相伴洗出；當乙醇達到20%時，EGCG和ECG的洗脫速率明顯變快。但是當乙醇達到30%時，洗脫液中的雜質種類明顯增多，故選擇20%乙醇作為洗脫劑。

2.5.2 洗脫流速 不同洗脫速度的洗脫效果見圖3。從圖3可以看出，當采用0.5 BV/h的洗脫速度進行洗脫時洗脫效果較好。

2.5.3 洗脫曲線 洗脫曲線見圖4。由圖4可以看出，從第15份洗脫液開始EGCG峰面積值很小，到第17份時已基本為零，表明此時大孔吸附樹脂吸附的EGCG已基本完全洗脫，故確定洗脫劑用量為4.0 BV。

3 小結與討論

運用靜態吸附與動態吸附相結合的方法找到適用于茶葉生產廢料提取物中EGCG分離純化用的大孔吸附樹脂為D101。其最佳分離純化條件為：將20.0 mg/mL上柱液以1.5 BV/h上柱4.5 BV，使用20%乙醇以0.5 BV/h洗脫4.0 BV。

從茶葉生產廢料中提取、分離純化EGCG的全過程均采用對設備和環境友好的乙醇水溶液作為溶劑，其兼容性及連續性增強，溶劑回收方便，能耗降低，生產周期縮短，且乙醇廉價無毒，對環境沒有污染，生產企業對“三廢”的處理成本也會大大降低，有利于企業大規模生產。

本研究從茶葉生產廢料中提取分離純化生產高附加值的EGCG，是茶葉產業鏈很好的延伸，與恩施州的產業鏈建設政策高度契合，且有利于充分利用恩施州的茶葉資源，變廢為寶，提高茶農的收入，為恩施州茶葉產業鏈的建設注入新的活力。

參考文獻：

[1] 黃思勇，金顯平，干國平，等.茶葉下腳料中茶多酚的提取純化工藝研究[J].湖北中醫藥大學學報，2011，13（4）：30-32.

[2] 伍紅良，凌月福，黃嵐珍，等.EGCG對鼻咽癌CNE-2細胞增殖、凋亡及survivin、VEGF表達的影響[J].實用醫學雜志，2011， 27（7）：1138-1141.

[3] 李浩榕，王亞楠，范春雷.表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制LDL的氧化修飾和小鼠巨噬細胞攝取ox-LDL[J].中國藥理學通報，2011，27（4）：584-585.

[4] 戚向陽.EGCG氧化產物不同級分的分析及其抗氧化活性的研究[J].茶葉科學，2008，28（6）：436-442.

[5] 張星海，唐德松，沈生榮，等.EGCG防癌抗癌的藥理藥效研究進展[J].茶葉，2001，27（4）：43-48.

[6] 鄒少娜，林 敏，伍石華，等.活性氧在EGCG誘導人胃癌MGC803細胞凋亡中的作用[J].中國癌癥雜志，2010，20（5）：344-347.

[7] 朱忠超，劉志蘇，艾中立，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯誘導肝癌細胞凋亡并伴隨端粒酶活性下調[J].武漢大學學報（醫學版），2004，25（6）：663-668.

[8] 黃思勇，干國平.茶葉下腳料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量測定研究[J].中國藥師，2012，15（5）：676-677.

[9] 黃思勇.茶葉下腳料中表沒食子兒茶素沒食子酸酯分離純化工藝研究[D].武漢：湖北中醫藥大學，2012.

[10] 林燕如，謝琳潔.金絲草總黃酮大孔樹脂純化工藝優化[J].湖北農業科學，2013，52（10）：2393-2396.

[11] 林燕如，曹遷永.大孔樹脂純化金毛狗脊葉黃酮的工藝研究[J].湖北農業科學，2011，50（3）：583-586.