高危型HPV載量及IFN γ基因多態性與LEEP術后CIN患者預后的相關性

陳艷，林琳，賈志強，陳尼婭

（溫州醫科大學附屬第三醫院 婦產科，浙江 溫州 325200）

高危型HPV載量及IFN γ基因多態性與LEEP術后CIN患者預后的相關性

陳艷，林琳，賈志強，陳尼婭

（溫州醫科大學附屬第三醫院 婦產科，浙江 溫州 325200）

目的：探討高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）載量及γ干擾素（IFNγ）基因多態性與宮頸上皮內瘤變（CIN）患者經環狀電圈切除（LEEP）術后病灶殘留或復發的關系，以及發病過程中的相關性。方法：所選來自本院門診或住院行LEEP術的HPV陽性患者共439例，并選取同期體檢HPV陰性的健康女性120例作為對照，采用基因測序方法檢測IFNγ基因多態性，術后3、6、9、12個月時復查高危型HPV DNA及宮頸新柏氏液基細胞學（TCT）檢測。結果：IFNγ基因多態性rs243056l位點TT基因型為HPV感染發病的保護因素（OR為0.471，95%CI：0.283～0.783；x2=8.702；P=0.003），AA基因型為HPV感染發病的危險因素（OR為1.688，95%CI：1.108～2.572；x2=6.005；P=0.014），術前及術后3個月HPV載量與病灶殘留/復發相關（P＜0.05）。Kaplan-Meier分析結果顯示，AA與TT基因型HPV感染累積陰性率有顯著差異（log-rank=15.414，P＜0.001），AA基因型女性HPV感染的累積陰性率最低，病灶殘留/復發率為45.65%。結論：術前及術后3個月高危型HPV載量與CIN的發生、進展及CIN患者LEEP術預后有關。IFNγ基因rs2430561位點多態性影響女性宮頸HPV的易感性，AA基因型女性感染風險更高，并易于HPV感染的持續和復發。

宮頸上皮內瘤樣病變；γ干擾素基因多態性；乳頭狀瘤病毒；病毒負荷量

宮頸癌是我國近年來婦科惡性疾病死亡的主要原因之一，而高危型人乳頭狀瘤病毒（human papil lornavirus，HPV）感染是宮頸癌和宮頸上皮內瘤變（cervical int raepithel ianeoplasia，CIN）發生的必要條件，近十余年來HPV載量檢查已成為國內CIN患者經環狀電圈切除（loop elect rosurgical excision procedure，LEEP）術后的隨訪內容。有文獻［1］表明，人體高水平的γ干擾素（IFNγ）能提高機體免疫力，可有效抵抗病毒（如HPV等）的感染，而IFNγ基因多態性與IFNγ表達量高度相關。但目前我國國內就IFNγ基因多態性對婦科腫瘤生物學方面影響的研究尚處于初步階段。本實驗對CIN患者進行LEEP術后隨訪，檢測術后高危型HPV載量以及所有研究對象的IFNγ基因多態性，以探討術后高危型HPV載量與CIN患者預后的關系，并進一步研究IFNγ基因多態性與HPV載量及預后的關系。

l 資料和方法

1.1 一般資料 所選對象均來自2009年6月至2013年12月在本院門診或住院行LEEP術的CIN患者，共478例，術后隨訪12個月，其中39例失訪，最后共納入439例為CIN組，年齡20～57歲，平均（38.98± 5.68）歲。所有LEEP術患者均由一位經驗豐富的醫師操作，以標本病理檢查結果為最終診斷，所有病理切片均由資深病理學專家復核。入選標準：既往無冠心病、腦血管病家族史、糖尿病、肝、腎、血液、自身免疫性疾病以及妊娠者。本研究通過本院倫理委員會批準，所有標本的收集均經受試者本人或家屬同意。排除標準：腦卒中，嚴重心臟疾病近期發生心肌梗死或心絞痛疾病，嚴重感染，嚴重肝、腎功能不全，血栓性疾病，腫瘤，曾行放化療或生物學治療患者。對照組為同期在本院體檢中心查體的HPV陰性健康女性，共120例，年齡21～56歲，平均（37.37±5.92）歲，均無CIN病史，宮頸細胞學檢查未見異常，且無腫瘤病史。CIN組與對照組均為浙江地區漢族女性。

1.2 高危型HPV-DNA檢測 高危型HPV-DNA檢測采用美國Digene公司HPV-DNA雜交捕獲I I（HC-I I）的方法，HC-I I試劑盒購自美國Digene公司。共檢測13個高危HPV基因型，包括HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。實驗嚴格參照試劑盒說明書進行操作。

1.3 rs2430561基因型檢測

1.3.1 DNA提?。核惺軝z者均晨起抽取靜脈血3 mL，采用DNA試劑盒（上海美吉生物醫藥科技有限公司）提取人類白細胞基因組DNA。將提取好的DNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 基因型檢測：基因引物（上海美吉生物醫藥科技有限公司）上游引物：5'-ACG TTG GAT GGA TAG TTC CAA ACA TGT GCG-3'，下游引物：5'-ACG TTG GAT GCA GAC ATT CAC AAT TGA TT-3'，行直接測序方法，讀取個體的基因型?；驕y序不同基因型見圖1-3。

1.4 LEEP術及隨訪內容 CIN患者均在月經期后1周行LEEP術。病理標本按國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstet rics，FIGO）診斷標準進行臨床分級：I級、I I級、I I I級。CIN組隨訪時間分別在第3、第6、第9、第12個月隨訪，以再次復查病灶殘留/復發作為終點事件。病灶殘留：術后檢測高危型HPV陽性、TCT仍異常且經陰道鏡下活檢證實病灶仍然存在；病灶復發：術后檢測高危型HPV曾為陰性，術后第6、第9、第12個月復診新檢出高危型HPV陽性者，TCT異常并經陰道鏡下活檢證實病灶存在［2］。

1.5 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件分析等位基因和基因型頻率與HPV感染的關聯性。經Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性，基因型及等位基因頻率的比較行x2檢驗，計量資料以表示，多組計量資料采用單因素方差分析。隨訪數據采用Kaplan-Meier法，以病灶殘留/復發作為終點事件，以log-rank法進行統計檢驗，并繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIN患者術前及術后隨訪HPV感染情況 CIN組439例中CIN I型201例（占45.79%），CIN I I型133例（占30.30%），CIN I I I型105例（占23.92%）。各病理類型術前高危型HPV載量間比較差異有統計學意義（P＜0.001），持續陽性者的各病理類型間比較差異無統計學意義（P=0.208），而病灶殘留/復發者的各病理類型間比較差異有統計學意義（P＜0.001），見表l。

2.2 不同IFNγ基因型與宮頸HPV感染風險的關系

CIN病例組和對照組IFNγ基因多態性rs243056l位點的基因型頻率及2組間IFNγ基因型分布差異有統計學意義（P＜0.05），CIN組和對照組T型等位基因頻率分別為32.92%和43.75%，且等位基因在2組間分布差異有統計學意義（P=0.002）。研究發現TT基因型為HPV感染發病的保護因素，而AA基因型為危險因素（見表2）。對IFN不同基因型HPV載量比較，AA基因型術前及術后3個月HPV載量較TA及TT基因型為高且差異有統計學意義（P＜0.001），見表3。

表1 CIN患者術前及術后隨訪HPV感染基本情況比較

表1 CIN患者術前及術后隨訪HPV感染基本情況比較

病理類型　n　　術前HPV載量（RLU/CO）　　術后3個月HPV載量（RLU/CO）　　持續陽性者　　病灶殘留或復發者CIN I級　201　460.83±268.71　 94.80±152.37　46/22.9　 3/ 1.5 CIN I I級　133　492.70±280.71　143.12±187.05　39/29.3　17/12.8 CIN I I I級　105　846.68±297.01　211.13±265.22　33/31.4　26/24.8 F/x2　71.909　 12.359　3.141　 40.891 P ＜0.001　?。?.001　0.208　?。?.001

表2 CIN組與對照組IFNγ基因多態性基因型分布和等位基因頻率分布 n（%）

表3 IFN不同基因型術前及術后3個月HPV載量比較

表3 IFN不同基因型術前及術后3個月HPV載量比較

與TT基因型比：aP＜0.05；與TA基因型比：bP＜0.05

組別　n　　術前HPV載量（RLU/CO）術后3個月HPV載量（RLU/CO）TT基因型　 55　546.17±339.06ab　70.63±135.31abTA基因型　179　478.97±322.46ab　52.19±112.29abAA基因型　205　640.40±297.02ab　229.43±232.24abF 12.798　 50.244 P ＜0.001　?。?.001

2.3 Hardy-Weinberg平衡分析 CIN組和對照組IFNγ基因多態性基因型Hardy-Weinberg平衡分析結果顯示，2組趨向遺傳平衡，見表4。

2.4 宮頸HPV持續陽性的相關分析 術后6個月持續陽性組與轉陰組間IFNγ基因型分布差異無統計學意義（P＞0.05）；2組T型等位基因頻率分別為27.54%和34.89%，等位基因在2組間分布差異有統計學意義（P=0.048）。AA基因型為HPV持續陽性發病的危險因素，見表5。持續陽性者術前HPV載量與轉陰患者比較差異無統計學意義（P＞0.05），持續陽性者術后3個月HPV載量較轉陰患者高，2者相比差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。

表4 CIN組與對照組IFNγ基因多態性基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗 n（%）

表5 術后6個月持續陽性者IFNγ基因型分布和等位基因頻率分布 n（%）

2.5 病灶殘留/復發風險的相關分析 結果顯示，術后12個月病灶殘留/復發組與轉陰組間IFNγ基因型分布無差異（P＞0.05）；2組T型等位基因頻率分別為33.70%和32.82%，等位基因在2組間分布差異無統計學意義（P＞0.05），見表7。病灶殘留/復發患者術前及術后3個月HPV載量較無復發患者顯著增高（P＜0.05），見表8。

2.6 IFNγ基因rs243056l位點基因型與隨訪期間HPV累積陰性率的關系 CIN組478例患者中39例失訪，平均隨訪時間12個月?？偛≡顨埩?復發率為10.48%（46/439），其中AA基因型中病灶殘留/復發率為45.65%（21/46）。經Kaplan-Meier法分析并繪制曲線后，隨訪期間IFNγ基因多態性AA與TT基因型累積HPV轉陰率存在統計學差異（log-rank檢驗統計量為15.414，P＜0.001），見圖4。

表6 持續陽性者術前和術后3個月HPV載量比較

表6 持續陽性者術前和術后3個月HPV載量比較

組別　n　　術前HPV載量（RLU/CO）術后3個月HPV載量（RLU/CO）持續陽性者　118　517.26±319.41　383.08±210.11轉陰者　321　579.50±320.89　 46.90± 90.15 t 1.804　16.821 P 0.072　?。?.001

表7 術后12個月病灶殘留/復發與轉陰組間IFNγ基因型分布和等位基因頻率分布 n（%）

表8 病灶殘留/復發病例組間術前及術后3個月HPV載量比較

表8 病灶殘留/復發病例組間術前及術后3個月HPV載量比較

組別　n　　術前HPV載量（RLU/CO）術后3個月HPV載量（RLU/CO）病灶殘留/復發　46　579.61±312.34　396.77±179.75轉陰者　393　418.96±362.60　106.89±197.30 t 3.243　 10.372 P ＜0.001　　＜0.001

圖1 SNP rs2430561測序TT基因型

3 討論

HPV的持續陽性是CIN發生發展的重要原因。有研究［17］表明，在溫州地區，30～40歲為HPV感染的高峰年齡，高危人群HPV感染率達38.7%，HPV感染的常見型別為HPVl6、52、58、6和11。高危型HPV的載量越高罹患CIN的危險性也越高，高載量高危型HPV者患原位癌發生概率較HPV陰性者顯著增高［3-4］。也有研究［5］表明，宮頸病變的級別越高，HPV感染率與HPV載量也隨之升高，且隨著HPV載量的增高，子宮頸癌發生的致病風險也隨之升高。本研究結果與上述研究結果基本一致，首先，CIN各病理類型與術前及術后第3個月HPV載量存在相關性，宮頸病變的程度越高，HPV載量隨之升高；其次，術前及術后第3個月HPV載量與CIN的進展密切相關，該結論與前期研究［6］結果一致；再次，術后第3個月HPV載量與CIN患者預后具有一定的相關性。

人類IFNγ基因定位于12q24.1，含有4個外顯子和3個內含子，其中第一內含子rs2430561正好位于轉錄因子NF-KappaB的結合位點，其多態性可影響與轉錄因子的結合進而影響IFNγ的轉錄和表達，并與多種疾病如病毒感染性疾病、肺結核、寄生蟲感染和腫瘤等密切相關。研究［1］表明TT為高表達基因型，AA為低表達基因型，TA為中等表達基因型。IFNγ的抗感染機制有多個學說，目前研究較為深入的是IFNγ與IFNγRl及IFNγR2結合，磷酸化絡氨酸蛋白激酶蛋白，然后依次激活JAK/STAT通路，使STAT轉錄因子激活。激活抗原呈遞細胞APCs，促進Thl分化，抑制Th2。主要在抗病毒感染和宿主抗腫瘤過程中起關鍵作用。本研究結果顯示，所有研究對象中HPV感染人群與健康人群IFNrs2430561位點基因多態性分布有顯著差異，其中TT基因型為HPV感染發病的保護因素（OR=0.471，P=0.003），AA基因型為危險因素（OR=1.688，P=0.014）。對照組中健康人群的TT、TA、AA基因型分別占23%、41%和36%。結合國內外相關文獻與不同國家人群相關報道進行比較，本研究結果與亞洲人群［7-9］基因型構成比相近，但與歐洲人群［10-12］、非洲人群［13-14］及美洲人群［15-16］基因型構成比略有差異。這些遺傳學上的差異可能是造成不同人群對某些疾病易感性異同的原因。

圖2 SNP rs2430561測序TA基因型

圖3 SNP rs2430561測序AA基因型

圖4 IFNγ基因rs243056l位點不同基因型與隨訪期間HPV累積轉陰率的關系

本研究HPV感染人群中IFNγ基因多態性rs2430561位點，TT基因型為HPV感染發病的保護因素（OR= 0.471），AA基因型為HPV感染發病的危險因素（OR= 1.688），AA基因型術前及術后3個月HPV載量較TA 及TT基因型為高。隨訪期間IFNγ不同基因型的HPV累積轉陰率有顯著差異（log-rank=15.414），AA基因型人群具有HPV持續陽性及復發傾向，且經統計推測AA基因型為HPV持續陽性發病的危險因素（OR= 1.586）。因此，可以推論AA基因型可能與宮頸癌前病變或宮頸癌的發生風險相關。但術后12個月病灶殘留/復發者IFNγ基因型分布差異無統計學意義（P= 0.987），考慮病灶殘留/復發可能與其他基因多態性及環境等多因素相關，不能僅僅用IFNγ基因多態性解釋。

本研究不足之處：①本研究樣本量仍偏小，結果仍有待擴大樣本量來證實；②由于技術原因，實驗未能直接證實IFNγ基因多態性rs2430561位點下游相關因子含量及其發生機制；③本研究中人群的其他生活習慣及環境因素控制欠佳；④仍需要進行更大樣本量的前瞻性研究或相匹配的病例對照研究來進一步明確是否rs2430561位點多態性與宮頸HPV感染風險相關，以減少偏倚。

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（本文編輯：胡苗苗）

Correlation among interferon-gamma gene polymorphism，viral load high-risk human papilloma virus rem ains and p rognosis after loop electrosurgical excision procedure for CIN patien ts

CHEN Yan，LIN Lin，JIA Zhiqiang，CHEN Niya. Department of Gynaecology and Obstetrics，the Third Affliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325200

Objective：To investigate the association of interferon-gamma gene polymorphisms and the correlation between viral load remains and recidivation after loop ment for CIN patients. M ethods：Performed gene analysis was used for detection of polymorphisms in interferon-gamma gene in 439 HPV positive patients undergone the LEEP treatment for CIN and 120 HPV negative normal controls，reviewed high-risk HPV DNA and cervix uterus TCT were reviewed in 3，6，9 and 12 months after treatment. Results：That the individuals w ith the TT genotype showed statistically signif cant had protection against HPV infection （OR=0.471，95%CI=0.283～0.783；x2=8.702，P=0.003）. That the individuals w ith the AA genotype show ed statistically signif cant increased risk for HPV infection （OR=1.688，95%CI=1.108～2.572； x2=6.005，P=0.014）. The viral load before and after 3 months LEEP treatment of high-risk HPV w as a risk factor of remains or recidivation after LEEP treatment （P＜0.05）. In the analysis of Kaplan-Meier，the cumulative HPV negative rates of AA and TT genotype exhibited signif cantly different （log-rank=15.414，P＜0.001）. The cumulative HPV negative rate of AA genotype was the lowest，the remains or recidivation rate of AA genotype was 45.65%. Conclusion：The viral load before and after 3 months LEEP treatment of high-risk HPV is related to CIN and the prognosis for CIN patients. Interferon-gamma gene rs2430561 polymorphisms affects the susceptibility to HPV infection. Women with AA genotype exhibited higher risk of infection and inclined to be continuous status and recurrence after HPV infection.

cervical intra-epithelial neoplasia； interferon-gamma gene polymorphism； human papilloma virus； viral load

R711.74

A DO I：10.3969/j.issn.2095-9400.2015.10.008

2015-01-12

瑞安市科技計劃項目（201102060）。

陳艷（1980-），女，浙江瑞安人，主治醫師，碩士。