血清分泌型Klotho蛋白評估維持性血液透析患者冠脈鈣化程度

鄭淑蓓，金領微，鄭育，周志宏

（溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027）

血清分泌型Klotho蛋白評估維持性血液透析患者冠脈鈣化程度

鄭淑蓓，金領微，鄭育，周志宏

（溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027）

目的：觀察維持性血液透析（MHD）患者血清分泌型Klotho蛋白與冠脈鈣化之間的關系，探討應用Klotho蛋白評估冠脈鈣化的可行性。方法：ELISA法測定MHD患者血清分泌型Klotho蛋白水平，MSCT測定冠脈鈣化積分（CACs）以評估冠脈鈣化程度。Spearman相關分析了解Klotho蛋白和冠脈鈣化間的關系，logistic回歸分析法分析MHD患者發生冠脈鈣化的危險因素。結果：共入選132例MHD患者，平均年齡（62.98± 15.38）歲，中位透析齡51.00（41.25，74.25）個月。69.70%患者存在冠脈鈣化，中位CACs為83.47（0，585.09），中位血清分泌型Klotho蛋白濃度為374.76（336.55，426.60）pg/mL，CACs與Klotho蛋白呈負相關（r=-0.294，P=0.001）。logist ic回歸分析顯示，Klotho蛋白降低是MHD患者發生冠脈中、重度鈣化的獨立危險因素。Klotho蛋白聯合傳統和慢性腎臟?。–KD）相關心血管危險因素具有更強的評估MHD患者冠脈中、重度鈣化的能力。結論：血清分泌型Klotho蛋白低的MHD患者具有較高發生冠脈鈣化的風險，Klotho蛋白聯合多個心血管危險因素可較好地評估患者冠脈中、重度鈣化。

維持性血液透析；Klotho蛋白；冠脈鈣化

Klotho基因是一種抑制老化的基因［1］，其編碼的Klotho蛋白分為膜型和分泌型，后者表達量明顯高于前者。目前認為分泌型Klotho蛋白作為一種激素參與對機體功能的調節，能促進內皮源性一氧化氮（nit rogen monoxide，NO）合成，保護內皮細胞，減輕動脈鈣化程度［2］。近年有作者報道Klotho蛋白表達與冠心病發病呈負相關，可能具有保護效應［3］。維持性血液透析（maintenance hemodialysis，MHD）患者由于慢性腎功能衰竭（chronic renal fai lure，CRF）及Klotho基因的表達受到嚴重影響出現k lotho蛋白水平降低［4］，有研究顯示分泌型Kl otho蛋白缺乏與慢性腎臟?。╟hroni c kidney disease，CKD）患者血管硬化相關［5］。本研究以MHD患者為對象，觀察血清分泌型Klotho蛋白與冠脈鈣化程度的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2012年12月至2014年8月在我院行MHD治療的患者132例，其中男78例，女54例；年齡26～94歲，平均（62.98±15.38）歲。透析齡10～204個月，中位51.00（41.25，74.25）個月。原發病為慢性腎小球腎炎48例（占36.4%），高血壓腎損害32例（占24.2%），糖尿病腎病31例（占23.5%），多囊腎8例（占6.1%），其他13例（占9.8%）。排除標準：①急性腎損害；②接受過冠脈搭橋術或者冠脈支架植入術；③快速性心房顫動、心律不齊或心動過速；④服用免疫抑制劑；⑤甲狀旁腺切除；⑥急性感染；⑦嚴重的肝、肺疾??；⑧精神疾患；⑨惡性腫瘤；⑩嚴重營養不良。所有患者均接受金寶透析機進行碳酸氫鹽血液透析，透析器為POLYFLUX 14L，每周血透3次，每次4 h，血管通路為自體動靜脈內瘺或頸內靜脈長期管，血流量260～300 mL/min，透析液流量500 mL/min，透析液鈣濃度為1.50 mmol/L。每次透析超濾以達到臨床估計的干體質量為目標，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集和分組：收集患者一般情況，包括性別、年齡、原發病、透析齡、體質量指數（body mass index，BMI）、吸煙史（吸煙＞10支/d并持續≥5年）等，并記錄患者透析前血壓。根據Rumberger冠脈鈣化程度分級法［6］將患者分成4組，0～10為無鈣化組，11～100為輕度鈣化組，101～400為中度鈣化組，＞400為重度鈣化組。

1.2.2 冠脈鈣化程度檢測：多層螺旋計算機斷層掃描（mul ti-sl ice spiral computed tomography，MSCT）測定的冠脈鈣化積分（coronary ar tery calci f icat ion score，CACs）可以定量判定冠脈鈣化程度［7］。用Phi l ips Br i l l iance 16排螺旋CT進行掃描，掃描前訓練患者屏氣，控制患者心率＜90 次/min，取仰臥位，頭先進，連接心電門控裝置。采用觸發式心電門控，患者一次屏氣完成主動脈根部至心尖部掃描。門控設定：觸發掃描點定于心電圖RR間期為75%，主要在心動舒張期獲得圖像。掃描方式3.0 mm×1.5 mm，掃描長度144 mm，共掃96層，掃描條件120 kV，55 mA/s。矩陣512×512，視野260 mm，像素0.26 mm。所有圖像經過降噪、去偽影處理。將重建所得的清晰數據傳送到達Vit rea I I. fx專屬圖形處理工作站，應用相應軟件系統進行后處理。關注的血管包括冠狀動脈左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈。冠脈鈣化程度由Agatston評分［8］量化，如果鈣化面積≥1 mm2，CT值峰值系數≥130 Hu，認為是鈣化灶。CT值在130～199 Hu之間的鈣化定為1；200～299 Hu之間的鈣化定為2；300～399 Hu之間的鈣化定為3；400 Hu以上定為4。每個鈣化病灶的CACs計算方法為：CT值峰值系數×相對應的鈣化面積（以1 mm2為單位），每1個斷層圖像獨立分析，將所有斷層的鈣化分數相加得到的總分即為該患者的CACs。CACs≥100是心血管疾病發生、發展的強有力證據［9］，提示冠脈中、重度鈣化患者心血管疾病發生率明顯增高。

1.2.3 實驗室檢查：所有患者于MSCT檢查前1周內測透前血紅蛋白、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、空腹血糖、血鈣、血磷、甲狀旁腺激素、甘油三脂、總膽固醇、低密度脂蛋白、白蛋白等，計算患者KT/V。酶聯免疫吸附（enzyme-l inked immunosorbent assay，ELISA）法檢測患者透前血清分泌型Klotho蛋白濃度，ELISA試劑盒購自上海博耀生物科技有限公司，按產品說明書進行操作。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。正態分布的計量資料用表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。非正態分布的計量資料用M（1/4，3/4）表示，組間比較采用Kruskal-Wal l is檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whi tney U檢驗。計數資料用例數和百分率描述，組間比較采用x2檢驗。采用Spearman相關分析了解分泌型Klotho蛋白與CACs的相關性，logistic回歸分析觀察Klotho蛋白與冠脈鈣化程度間的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者冠脈鈣化程度和臨床情況比較 132例患者CACs范圍0～13 450.20，中位CACs 83.47 （0，585.09），冠脈鈣化發生率為69.70%（CACs＞0）。各組間糖尿病患病率比較差異有統計學意義（P＜0.05），且無鈣化組糖尿病患病率最低；年齡、透析齡、收縮壓，各組間差異均有統計學意義（均P＜0.05），且重度鈣化組年齡和透析齡最長。各組間性別、吸煙史、飲酒史及高血壓病患病率、BMI、舒張壓、KT/V差異無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 各組患者冠脈鈣化程度和臨床情況比較

2.2 冠脈鈣化程度與血清分泌型Klotho蛋白關系

132例患者血清分泌型Klotho蛋白范圍為227.27～530.62 pg/mL。Klotho蛋白在不同冠脈鈣化組間比較差異均有統計學意義，且冠脈中、重度鈣化組Klotho蛋白水平顯著低于無鈣化組（均P＜0.05）。各組患者透析前血磷、鈣磷乘積在各組間比較差異有統計學意義（均P＜0.05），且重度鈣化組血磷、鈣磷乘積最高，見表2。血清分泌型Klotho蛋白的中位數以374.76 pg/mL為分界線，高于374.76 pg/mL為升高，低于374.76 pg/mL為降低，比較各組冠脈鈣化患者Klotho蛋白程度，差異有統計學意義（P＜0.05），無鈣化組以Klotho蛋白升高為主（占64.58%），而中、重度鈣化組患者以Klotho蛋白降低為主（占63.16%和62.22%）。Spearman相關分析顯示MHD患者CACs與血清分泌型Klotho蛋白呈負相關（r=-0.294，P=0.001）。見圖1。

表2 各組患者生化指標情況比較

圖1 各組兩種Klotho水平患者所占比例

2.3 各組患者冠脈鈣化與血清分泌型Klotho蛋白危險度關系 將冠脈中、重度鈣化設為因變量，logistic回歸分析顯示，血清分泌型Klotho蛋白、性別、年齡、鈣磷乘積、透析齡是MHD冠脈中、重度鈣化的重要危險因素，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

根據血清分泌型Klotho蛋白中位數374.76 pg/mL分組，logist ic回歸分析顯示Klotho蛋白降低可顯著升高MHD患者冠脈中、重度鈣化的風險；即使調整CKD相關心血管危險因素（如尿酸、血鈣、血磷、鈣磷乘積、甲狀旁腺激素、透析齡、KT/V）和傳統心血管危險因素（如性別、年齡、血壓、空腹血糖、總膽固醇、低密度脂蛋白、吸煙史、糖尿病史），其危險度依然增高。Klotho蛋白每減少1個標準差（61.92 pg/mL），患者發生冠脈中、重度鈣化的風險約增加0.5倍，見表4。

表3 MHD患者冠脈中、重度鈣化與相關因素的logistic回歸分析

表4 血清分泌型Klotho蛋白與冠脈中、重度鈣化風險的關系

3 討論

MHD患者普遍存在冠脈鈣化，比普通人群高2.5～5倍［10］。冠脈鈣化嚴重的MHD患者常因伴發心血管事件需要增加醫療費用，而且其住院、死亡風險升高。因此重視冠脈鈣化的篩查并及時干預，有助于改善患者預后，節省社會衛生資源。臨床上診斷血管鈣化的方法很多，其中以CT為基礎的診斷技術，如MSCT被認為是檢測血管鈣化的金標準。我們應用MSCT檢查本院MHD患者的冠脈情況，發現冠脈鈣化發生率為69.70%，提示MHD患者冠脈鈣化發生率較高，與文獻［11］報道基本一致。

MHD患者冠脈鈣化的傳統危險因素如老年、高血脂、高血壓、糖尿病是比較常見的。我們的研究結果也提示伴有高齡、高收縮壓、糖尿病的患者冠脈鈣化程度較重，但血脂影響不明顯，考慮可能與藥物干預相關。其中高齡、性別（男性）是MHD患者冠脈中、重度鈣化的獨立危險因素。CKD相關心血管危險因素如鈣磷代謝紊亂、異常氧化應激反應、長透析齡等在冠脈鈣化中亦有一定影響。我們研究結果提示高血磷、高鈣磷乘積的患者冠脈鈣化較重，與Raggi等［10］研究結果相符，同時長透析齡患者冠脈鈣化程度亦較重。其中鈣磷乘積、長透析齡亦是冠脈中、重度鈣化的獨立危險因素。

MHD患者體內異常的氧化應激反應可引起內皮細胞功能障礙，而后者正是動脈鈣化形成的關鍵環節。近年研究發現Klotho蛋白可通過調節體內氧化和抗氧化之間的平衡，改善內皮細胞功能，延緩動脈鈣化的發生發展。Klotho基因缺陷小鼠在出生后4周即出現動脈硬化，并隨增齡而加重，表現為主動脈嚴重鈣化、肌性中動脈中層鈣化、內膜增厚、腎臟小動脈嚴重鈣化等，這些血管變化與人類動脈硬化非常相似。把外源性Klotho的cDNA轉入Klotho基因缺陷小鼠，數周后其動脈硬化程度可得到顯著改善［1］。其機制為Klotho基因缺陷導致血管內皮細胞功能失調，特別是NO合成下降［12］。而NO作為內源性血管舒張因子的主要成分，能抑制血管壁及循環血中的一些活性因子，從而抑制血管平滑肌細胞增生，防止內皮損傷及動脈硬化形成［13］。由于RTPCR檢測表明血管內皮細胞中無Klotho基因表達，Sai to等［12］進一步證實Klotho基因維持血管內皮細胞分泌NO是通過其分泌型Klotho蛋白來實現的。Klotho蛋白也可抑制P53/P21表達，緩解過氧化氫所誘導的內皮細胞衰老，延緩動脈硬化的發生［14］。劉威等［3］對80例冠心病患者與100例對照者進行危險因素調查，發現冠心病患者血清Klotho蛋白濃度低于對照組，血清Klotho蛋白對于預防冠心病有保護效應。更引人關注的是，Klotho基因只在腎臟、腦的脈絡膜、生殖器官等有限的組織器官中表達，特別是在腎小管上皮細胞中強表達［2，15］，提示Klotho的功能可能與腎臟病患者系列并發癥的發生有關。Koh等［16］觀察10例臨床或組織學診斷為CRF的患者腎組織中Klotho的變化，結果顯示其Klotho mRNA均明顯降低，Klotho蛋白表達也顯著降低。蔡宏等［17］探討了維持性血液透析患者血管鈣化與血清Klotho蛋白之間的關系，發現Klotho蛋白濃度降低是MHD患者腹主動脈重度鈣化的獨立危險因素。我們研究發現，MHD患者隨著血清分泌型Klotho蛋白水平的降低，冠脈鈣化程度趨向嚴重，CACs與Klotho蛋白呈負相關，與既往報道［18］相符。logistic分析顯示，Klotho蛋白降低是MHD患者發生冠脈中、重度鈣化的獨立危險因素。Klotho蛋白尤其是Klotho蛋白聯合CKD相關和傳統心血管危險因素，可以較準確地評估MHD患者冠脈中、重度鈣化。

MHD患者冠脈鈣化較普遍，血清分泌型Kl otho蛋白和MHD患者冠脈鈣化程度相關，為其發生冠脈中、重度鈣化的獨立危險因素。Klotho蛋白聯合多個心血管危險因素有助于MHD患者冠脈中、重度鈣化的篩查，具有一定的應用前景。

［1］ Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing ［J］. Nature，1997，390（6655）：45-51.

［2］ Li SA，Watanabe M，Yamada H，et al. Immunohistochem ical localization of K lotho protein in brain，kidney，and reproductive organs of m ice［J］. Cell Struct Funct，2004，29（4）：91-99.

［3］ 劉威，康林，曹貴方. 血清KLOTHO濃度與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的關系［J］. 嶺南心血管病雜志，2012，18（5）：463-464，534.

［4］ Sun CY，Chang SC，Wu MS. Suppression of K lotho expression by protein-bound urem ic toxins is associated w ith increased DNA methyltransferase expression and DNA hypermethylation［J］. Kidney Int，2012，81（7）：640-650.

［5］ Kitagawa M，Sugiyama H，Morinaga H，et al. A decreased level of serum soluble K lotho is an independent biomarker associated w ith arterial stiffness in patients w ith chronic kidney disease［J］. PLoS One，2013，8（2）：e56695.

［6］ Broderick LS，Shemesh J，Wilensky RL，et al. Measurement of coronary artery calcium w ith dual-slice helical CT compared w ith coronary angiography：evaluation of CT scoring methods，interobserver variations，and reproducibility［J］. AJR Am J Roentgenol，1996，167（2）：439-444.

［7］ Bellasi A，Lacey C，Taylor AJ，et al. Com parison of prognostic usefulness of coronary artery calcium in men versus women （results from a meta- and pooled analysis estimating all-cause mortality and coronary heart disease death or myocardial infarction）［J］. Am J Cardiol，2007，100（3）：409-414.

［8］ Agatston AS，Janow itz WR，Hildner FJ，et al. Quantif cation of coronary artery calcium using ultrafast computed tomography［J］.J Am Coll Cardiol，1990，15（4）：827-832.

［9］ Haberl R，Becker A，Leber A，et a1. Correlation of coronary calcification and angiographically documented stenoses in patients w ith suspected coronary artery disease：results of 1764 patients［J］. J Am Coll Cardiol，2001，37（2）：451-457.

［10］ Raggi P. Detection and quantif cation of cardiovascular calcif cation with electron beam tomography to estimate risk in hemodialysis patients［J］. Clin Nephrol，2000，54（4）：325-333.

［11］ 張文學，張媛元，林曉敏，等. 血液透析者冠狀動脈鈣化的相關因素分析［J］. 中國中西醫結合腎病雜志，2009，10（11）：981-983.

［12］ Saito Y，Yamagishi T，Nakamura T，et al. K lotho protein pro-tects against endothelial dysfunction［J］. Biochem Biophys Res Commun，1998，248（2）：324-329.

［13］ Langberg JJ，Gallagher M，Strickberger SA，et al. Temperature-guided radiofrequency catheter ablation w ith very large distal electrodes［J］. Circulation，1993，88（1）：245-249.

［14］ Ikushima M，Rakugi H，Ishikawa K，et al. Anti-apoptotic and anti-senescence effects of K lotho on vascular endothelial cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2006，339（3）：827-832.

［15］ Negri AL. The klotho gene：a gene predom inantly expressed in the kidney is a fundamental regulator of aging and calcium/phosphorus metabolism［J］. J Nephrol，2005，18（6）：654-658.

［16］ Koh N，Fujimori T，Nishiguchi S，et al. Severely reduced production of klotho in human chronic renal failure kidney ［J］. Biochem Biophys Res Commun，2001，280（4）：1015-1020.

［17］ 蔡宏，嚴玉澄，陸任華，等. 血清可溶性Klotho水平與維持性血液透析患者腹主動脈鈣化相關［J］. 中華腎臟病雜志，2013，29（2）：103-107.

［18］ 鄭淑蓓，金領微，周志宏. 維持性血液透析患者血清分泌型Klotho蛋白與冠狀動脈粥樣硬化的關系［J］. 溫州醫科大學學報，2015，45（4）：281-285.

（本文編輯：吳彬）

Serum secretory K lotho protein estim ating the calcification degree of coronary artery in patients on maintenance hemodialysis

ZHENG Shubei，JIN Lingwei，ZHENG Yu，ZHOU Zhihong. Department of Nephrology，the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325027

Ob jective：To observe the relationship between serum secretory Klotho protein and coronary artery calcif cation in maintenance hemodialysis （MHD） patients，and to explore the possibility of estimating calcif cation of coronary artery using K lotho protein. M ethods：MHD patients w ere selected. Serum secretory K lotho protein was detected w ith ELISA，and multi-slice spiral CT （MSCT） was used to detect coronary artery calcif cation score （CACs）. Spearman correlation coeff cient was used to analyze the relationship between K lotho protein and CACs. logistic regression analysis w as used to determ ine the risk factors of calcif cation of coronary artery in MHD patients. Results：132 MHD patients were recruited，their average age was 62.98±15.38 years old and the median of dialysis vintage was 51.00 months. Coronary artery calcif cation was detected in 69.70% patients w ith the median CACs of 83.47 （0～585.09）. The median K lotho protein w as 374.76 （336.55，426.60） pg/m L. Correlative analysis showed that K lotho protein was negatively correlated with CACs （r=-0.294，P=0.001）. logistic regression analysis showed that the risk of moderate-severe coronary artery calcif cation increased in association w ith the decreased level of K lotho protein. W hen K lotho protein combined w ith the CKD-related cardiovascular risk factors and the traditional cardiovascular risk factors，the prediction of moderate-severe coronary artery calcif cation became more powerful for MHD patients. Conclusion：The lower serum secretory K lotho protein is independently associated w ith coronary artery calcif cation. Serum secretory K lotho protein combined w ith cardiovascular risk factors may be used to predict the moderate-severe coronary artery calcif cation in MHD patients.

maintenance hemodialysis； K lotho protein； coronary artery calcif cation

·消 息·

R459.5；R541.4

A DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2015.10.005

2014-12-09

溫州市科技計劃項目（Y20140057）。

鄭淑蓓（1979-），女，浙江溫州人，主治醫師，碩士。