姜黃素通過上調SOCS表達抑制JAK2/STAT信號通路的機制

邢沖云，周琳，莊強，湯麗苑

（溫州醫科大學附屬第一醫院 血液科，浙江 溫州 325015）

姜黃素通過上調SOCS表達抑制JAK2/STAT信號通路的機制

邢沖云，周琳，莊強，湯麗苑

（溫州醫科大學附屬第一醫院 血液科，浙江 溫州 325015）

目的：研究姜黃素在骨髓增殖性腫瘤（MPNs）中通過調節細胞因子信號轉導抑制蛋白1、3（SOCS1、SOCS3）表達抑制JAK2/STAT信號通路的機制。方法：體外培養HEL及32D細胞株，分別用40 μmol/L姜黃素處理24、48 h。通過Western blot法檢測JAK2/STAT信號通路及SOCS1、SOCS3蛋白表達水平；通過染色體免疫共沉淀法檢測組蛋白乙酰化程度改變；通過比色法檢測組蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性。結果：體外實驗表明姜黃素顯著抑制HEL及32D細胞JAK2/STAT信號通路。姜黃素能夠抑制HDAC活性，同時降低HDAC1、HDAC3和HDAC8表達。姜黃素通過抑制HDAC活性，進而增強SOCS1、SOCS3啟動子組蛋白乙酰化程度，從而上調SOCS1、SOCS3 mRNA及蛋白表達水平。結論：姜黃素通過上調SOCS1、SOCS3表達水平抑制JAK2/STAT信號通路。作為一個相對無毒的天然小分子化合物，姜黃素聯合其他抑制JAK2/STAT信號通路的藥物可能有助于MPNs的臨床治療。

姜黃素；骨髓增殖性腫瘤； 組蛋白去乙酰化酶；細胞因子信號轉導抑制蛋白

細胞因子信號轉導抑制蛋白（suppressors of cytokine signaling，SOCS）1、3是重要的負反饋調節蛋白，通過抑制JAK2/STAT信號通路發揮抑制骨髓增殖性腫瘤（myeloprol i ferative neoplasms，MPNs）細胞增殖的作用［1］。SOCS1直接結合JAK2蛋白，而SOCS3通過結合細胞因子間接靶向結合JAK2蛋白，最終SOCS1、SOCS3蛋白通過E3泛素化途徑快速降解JAK2蛋白。已有研究證明，JAK2V617F突變［2］和MPL515突變［3］激活JAK2/STAT信號通路，此信號

的激活導致MPNs細胞異常增殖，并最終導致MPNs的發生。JAK2V617F突變使得SOCS3蛋白磷酸化，并且使之失去抑制JAK2/STAT信號通路的能力［4］。姜黃素（curcumin）是一種植物多酚，能夠抑制JAK2/ STAT信號通路，從而抑制腫瘤的生長。本研究探討姜黃素通過調節SOCS1、SOCS3表達抑制JAK/STAT信號通路的機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株 HEL及32D購買自上海中科院細胞庫，常規RPMI 1640 10%胎牛血清培養。32D細胞在培養過程中加入10 ng/mL的IL-3。

1.2 JAK2/STAT信號通路相關蛋白表達的檢測 采用Western blot法對HEL及32D細胞株SOCS1、SOCS3、JAK2蛋白、STAT5蛋白、磷酸化JAK2（p-JAK2）及磷酸化STAT5（p-STAT5）蛋白表達進行檢測，并用Biolab凝膠成像系統進行測定。以上抗體、HRP標記羊抗兔二抗均為美國CST公司產品。

1.3 總RNA的提取和反轉錄反應 常規Trizol方法提取總RNA，紫外分光光度計（Beckman）定量，-80 ℃凍存。反轉錄反應采用Fermentas反轉錄試劑盒，反應體系25 μL，包括1 μL總RNA、5×RT緩沖液5 μL、2 mmoL/L dNTP 1 μL、RNasin 1 μL、Random primer 1 μL、MMLV 1 μL、H2O 15 μL。反應條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，75 ℃10 min，-20 ℃保存備用。

1.4 乙酰化程度的檢測 染色體免疫共沉淀法（采用Mil l ipore公司EZ ChIPTMChromatin Immunoprecipi tation Ki t）檢測乙酰化程度變化。1×107細胞體外用甲醛交聯后，SDS裂解液徹底裂解細胞。冰上超聲裂解DNA，提取上清液加入5.0 μg相應抗體，4 ℃過夜。每個IP管吸取10 μL作為Input。Protein G樹脂吸附蛋白抗體混合物后，依次經過洗脫去交聯。DNA純化后用標準熒光定量PCR檢測，與Iuput比較后得出乙酰基富集程度變化。所用特異性引物如下：SOCS1-C1-179F：GACTTGGTGCTCCGTGCT，-54R：CGGGAGAGACAAAGAGGTGA；SOCS1-C2-503F：GCG GCCGCGATGCCCCTGA，-375R：CCCGCCGCCTGCTGGCCA；SOCS3-C1-765F：AGGCTCCTTTGTGGACTTCA，-624R：CTTCCTACCTGGTCCCGAAT；SOCS3-C2-299F：CCACGCTG CGCCCTTGCA，-160R：CCGAGCGACTGGGGCACCCA。

1.5 酶活性測定 采用比色法（試劑盒購自美國Upstate公司）檢測組蛋白去乙酰化酶（histone deacet y l ases，HDAC）活性變化。提取10、20、40 μmol/L姜黃素處理24、48 h后HEL及32D細胞核蛋白，加入HDAC底物，37 ℃溫育1 h，加入激活劑后，測定405 nm吸光度值。

1.6 統計學處理方法 采用SPSS 13.0統計軟件。組間均值比較采用Student's t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素通過上調SOCS1、SOCS3蛋白表達抑制JAK2/STAT信號通路 HEL細胞株因為攜帶JAK2V617F突變，JAK2/STAT信號通路持續活化；小鼠前體細胞株32D細胞加IL-3處理后，JAK2/STAT信號通路亦持續活化。為闡明姜黃素是否能夠抑制JAK2/STAT信號通路，上述2種細胞在體外用40 μmol/L姜黃素處理24、48 h后，通過Western blot法檢測JAK2/ STAT5信號通路，結果發現姜黃素不僅降低總的JAK2 和STAT5蛋白水平，而且下調p-JAK2和p-STAT5蛋白水平（見圖1A-B）。進一步研究發現，40 μmol/L姜黃素顯著上調SOCS1、SOCS3蛋白（見圖1C-D）及mRNA（見圖1E-F）表達水平。

圖1 姜黃素通過上調SOCS1/3蛋白表達抑制JAK2/STAT信號通路

2.2 姜黃素抑制HDAC酶活性及HDAC1、HDAC3和HDAC8表達水平 HEL和32D細胞在體外用10、20、40 μmol/L姜黃素處理48 h后，檢測HDAC酶活性，發現姜黃素以劑量依賴方式抑制HEL和32D細胞HDAC酶活性（見圖2A）。進一步研究發現，姜黃素降低HDAC1、HDAC3及HDAC8蛋白表達水平，但是對HDAC2表達沒有影響（見圖2B-C）。

圖2 姜黃素抑制HDAC酶活性及HDAC1、HDAC3和HDAC8表達

2.3 姜黃素增強SOCS1、SOCS3啟動子組蛋白乙酰化程度 如圖3A所示：在SOCS1、SOCS3轉錄啟始位點前1 000 bp內分別設計2對引物，通過染色體免疫共沉淀方法檢測姜黃素是否影響SOCS1/3啟動子組蛋白乙酰基表達水平，結果發現姜黃素明顯增強SOCS1、SOCS3啟動子組蛋白H3及H4乙酰化程度（見圖3B-C）。

3 討論

組蛋白及非組蛋白的乙酰基修飾在癌癥的發展中起重要作用。到目前為止，一共發現4組18種HDAC，其中研究最廣泛的是I類HDAC，包括HDAC1～3和HDAC8。HDAC1～3在各類癌細胞中高表達，并且促進細胞增殖，抑制凋亡及分化［5］。在前列腺癌細胞中抑制HDAC1表達有助于抑制細胞增殖及促進細胞凋亡［6］。美國FDA已批準HDAC抑制劑伏立諾他（vorinostat）治療難治性T細胞淋巴瘤［7］。雖然化學合成的HDAC抑制劑呈現出強大的抑制HDAC能力及良好的治療效果，但其嚴重的不良反應限制了這些藥物的進一步應用［8-9］。因此，在天然植物來源的小分子化合物中尋找低毒或無毒的HDAC抑制劑顯得非常重要。

姜黃素是從姜黃屬植物根莖姜黃中提取的一種植物多酚，已廣泛用于食品色素、防腐劑及佐味劑中［10］。姜黃素具有多方面的藥理作用，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎［11］以及神經保護作用［12］等。姜黃素通過作用多種信號通路和轉錄因子，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和耐藥［13-14］。例如：姜黃素在霍奇金淋巴瘤中抑制持續活化的NF-κB和STAT3信號通路［14］；姜黃素抑制K562細胞中STAT3/5入核［15］；在小細胞肺癌中，姜黃素通過降低p-JAK2和p-STAT3的水平，抑制細胞周期進展、遷移、增殖、浸潤和血管生成［16］；姜黃素通過溶血磷脂酸誘導的STAT3磷酸化和IL-6與IL-8的分泌，導致卵巢癌細胞運動受阻［17］；在T淋巴細胞白血病中，姜黃素降低磷酸化JAK3、STAT3和STAT5表達水平［18］。然而，姜黃素抑制JAK2/STAT信號通路的機制仍不明確。

圖3 姜黃素增強SOCS1、SOCS3啟動子組蛋白乙酰化程度改變。

飲食和環境因素可以導致表觀遺傳學的改變，而異常的表觀遺傳學通過腫瘤抑制基因的失活參與腫瘤的發生。姜黃素和其他飲食成分可以逆轉表觀遺傳學的改變。在MPNs中，SOCS1和SOCS3表觀遺傳學的異常已有大量研究。Capel lo等［19］報道，SOCS3甲基化發生在MPNs（占41.1%）和移植后髓系白血病（占58.8%），并導致轉錄沉默，而SOCS1的甲基化只見于小部分的MPNs（占13.4%）和移植后髓系白血病（占15%）。然而，Fourouclas等［20］指出，SOCS3甲基化只見于23%的特發性骨髓纖維化（idiopathic myelof ibrosis，IMF）患者中，未見于真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）和原發性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）患者。SOCS3甲基化在MPNs中的不一致性，可能由于在不同SOCS3啟動子區域CpG島甲基化的缺失，或者由于不同的患者入選標準。但是，HDACs是否影響SOCS1、SOCS3的表達并未完全闡明。已有文獻［21］報道，TSA通過上調SOCS1、SOCS3表達抑制結腸癌細胞的JAK2/STAT信號通路。HDAC抑制劑伏立諾他在小鼠PV模型中升高SOCS1、SOCS3的表達水平［22］。總之，DNA甲基化和HDAC調節SOCS1、SOCS3表達水平。本結果顯示，姜黃素降低了HDAC的活性，減少了HDAC1、HDAC3及HDAC8表達水平，通過增加SOCS1、SOCS3啟動子區域組氨酸乙酰化水平而上調SOCS1、SOCS3的表達，因此，我們推斷，姜黃素通過抑制HDAC活性增加SOCS1、SOCS3表達。

姜黃素能阻斷Raj i細胞和髓母細胞瘤細胞的HDAC活性［13，23］。在髓母細胞瘤細胞中，姜黃素通過阻斷HDAC活性和降低HDAC4表達誘導細胞凋亡和G2/M期細胞周期停滯［13］。而且，姜黃素聯合HDAC抑制劑呈現更強的抗腫瘤活性。在SkBr3和435eB乳腺癌細胞中，姜黃素聯合TSA產生了比單用任一個藥物更強的抗增殖和凋亡作用［24］。姜黃素在低于中毒濃度下，使腫瘤細胞對HDAC抑制劑伏立諾他和帕比司他（panobinostat）誘導的細胞抑制和凋亡更敏感［25］。因此，與其他藥物聯合，姜黃素有可能成為治療MPNs和白血病的藥物。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Cu rcum in inhibits JAK 2/STAT signaling th rough increasing the expression of SOCS in m yeloproliferative neop lasm s

XING Chongyun，ZHOU Lin，ZHUANG Qiang，TANG Liyuan. Department of Hematology，the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Ob jective：To investigate the mechanism of curcum in in inhibiting JAK2/STAT signaling through increasing the expression of SOCS1/3 in myeloproliferative neoplasms. M ethods：JAK2/STAT signaling and protein levels of SOCS1/3 were detected by Western blotting in HEL and 32D. Acetylation of histone in the regions of SOCS1/3 promoter was detected by immunoprecipitation assay. Furthermore，HDAC enzyme activity was detected by colorimetric HDAC activity assay kit. Resu lts：Curcumin inhibited JAK2/STAT signaling in HEL and 32D cells in vitro. Curcum in could inhibite HDAC enzyme activities and decreased the levels of HDAC1，3 and 8. Curcum in elevated the m RNA and protein levels of SOCS1/3 via triggering acetylation of histone in the regions of SOCS1/3 promoter. Conclusion：Taken together，our data uncover a regulatory mechanism of SOCS1/3 through inhibition of HDAC activity by curcum in.

curcum in； myeloproliferative neoplasm s； histone deacetylases； suppressors of cytokine signaling

R96

A DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2015.10.004

2015-03-12

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20130044）。

邢沖云（1978-），男，浙江奉化人，主治醫師，碩士。