單寧酸對臨床菌株的抗菌活性及其對生物膜的影響

尉驍，侯淵博，周鐵麗，陳華樂，李斌，杜佳，曹建明

（1.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院、生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

單寧酸對臨床菌株的抗菌活性及其對生物膜的影響

尉驍1，侯淵博1，周鐵麗2，陳華樂2，李斌2，杜佳2，曹建明1

（1.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院、生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

目的：分析單寧酸對臨床常見分離菌株的抗菌活性及其對生物膜的影響。方法：收集9種臨床常見分離菌株：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌。采用瓊脂稀釋法測定各種抗菌藥物對上述臨床菌株的最低抑菌濃度（MIC），根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，將每種臨床菌株分為多重耐藥（MDR）組和非多重耐藥（nMDR）組，分別從各組隨機抽取30株共540株菌作為實驗菌株。采用瓊脂稀釋法檢測單寧酸對上述菌株的MIC值，比較2組的差異。將單寧酸加入到生物膜培養(yǎng)基里以檢測其對各組細菌生物膜形成的影響。結(jié)果：單寧酸對9種臨床菌株均表現(xiàn)出較強的抗菌活性，其中對葡萄球菌屬細菌的抗菌活性明顯大于對其他菌的活性（P＜0.05）。單寧酸對細菌生物膜形成有一定的抑制作用。結(jié)論：單寧酸對臨床常見分離菌株有抗菌作用且可以影響生物膜的形成。

單寧酸；多重耐藥；抗菌活性；生物膜

近年來，由于抗菌藥物的大量使用，臨床分離細菌的耐藥現(xiàn)狀日益嚴峻，各種耐藥細菌相繼出現(xiàn)，嚴重威脅著人類健康［1］。盡管人們正在努力控制耐藥細菌的增加并不斷研制各種新型抗菌藥物來消滅這些細菌，但細菌的變異速度及耐藥基因的傳播速度遠遠快于人們發(fā)現(xiàn)新型抗菌藥物的速度［2］。傳統(tǒng)藥方中的兒茶膏、五倍子等，主要有效成分為單寧酸（tannic acid），一直以來就有保護傷部、防止傷口感染等功效［3-4］，但是關于其具體的抗菌活性以及對細菌生物膜抑制作用的相關研究尚少。本實驗就以上兩個方面對單寧酸進行研究分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及來源：實驗菌株包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis）、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyt icus，S.haemolyt icus）、大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.faecal is）、屎腸球菌（Enterococcus faecium，E.faecium）、肺炎克雷伯菌（Klebsiel la pneumoniae，K.pneumoniae）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）均分離自2013-2014年溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床送檢的各類標本。所有菌株經(jīng)VITEK全自動微生物分析儀鑒定確認。E.col i ATCC25922、P.aeruginosa ATCC27853、K.pneumoniae ATCC13883、A.baumannii ATCC19606、S.aureus ATCC25923購自美國國家標準菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 儀器與試劑：VITEK細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司）；全功能微孔板檢測酶標儀（美國Biotek公司）；單寧酸（Solarbio公司）；無菌磷酸鹽緩沖液（美國Thermo公司）；液體LB培養(yǎng)基、胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（英國Oxid公司）；MTS測試條（意大利Liof ilchem公司）；頭孢菌素類、碳青霉烯類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、糖肽類等抗菌藥物標準品購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗：所有臨床菌株經(jīng)VITEK全自動微生物分析儀進行常用抗菌藥物的敏感性檢測，同時采用瓊脂稀釋法測定抗菌藥物對臨床菌株的最低抑菌濃度（minimal inhibi tory concent rat ion，MIC），藥敏結(jié)果解釋參照CLSI 2013標準［5］，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果將9種臨床菌株分為多重耐藥（mul t idrugresistant，MDR）組和非多重耐藥（non-mul t idrugresistant，nMDR）組［6］，從中各隨機抽取30株共540株菌作為本研究實驗菌株。

1.2.2 單寧酸抗菌實驗：采用瓊脂稀釋法測定單寧酸對試驗菌株的MIC。①配制單寧酸溶液原液（200 mg·mL-1），備用。②以藥物原液為基礎進行2倍系列稀釋，使其終濃度范圍為0.01～1.5 mg·mL-1。③分別取每一濃度藥物溶液2 mL加入一系列已做好標記的內(nèi)徑為90 mm的平板內(nèi)。再取冷卻至50 ℃左右的MH瓊脂18 mL加入平板（藥物∶瓊脂=1∶9），并充分混勻，待室溫凝固后備用。④將0.5麥氏濁度的各種菌液稀釋10倍，用多頭接種儀吸取1～2 μL菌液接種在含藥平板上，置35 ℃孵育16～20 h。觀察菌落生長情況，無菌落生長的平板所含的單寧酸濃度即為單寧酸對該菌的MIC值。

1.2.3 生物膜實驗：采用96孔板結(jié)晶紫染色法測定菌株體外生物膜形成能力。①菌株的活化：用接種環(huán)取一環(huán)純化后保存于-80 ℃的菌種，三區(qū)劃線接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，35 ℃恒溫靜置培養(yǎng)18 h。②菌株的培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取上述培養(yǎng)后的單個菌落于4 mL LB培養(yǎng)基中，35 ℃條件下120 r/min振蕩培養(yǎng)18～20 h。吸取10 μL菌液至新鮮的4 mL LB培養(yǎng)基中進行亞培養(yǎng)。同樣的方法共進行3次亞培養(yǎng)。③生物膜的培養(yǎng)：將亞培養(yǎng)后獲得的菌液用LB調(diào)至0.5麥氏濁度，然后吸10 μL菌液加入到含有190 μL LB培養(yǎng)基的96孔細胞培養(yǎng)板，作為陰性對照；吸10 μL菌液和10 μL濃度為1.6 mg·mL-1的單寧酸加入到含有180 μL LB培養(yǎng)基的96孔細胞培養(yǎng)板中，作為實驗組；每株菌同時做3個復孔，在最后3個孔中僅加入200 μL LB作為空白對照。35 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。④生物膜的測定：吸去上層浮游菌，在風干后加入200 μL結(jié)晶紫染液，震蕩3～5次，靜置染色20 min，棄去染液，置自來水水流下沖洗染液，直至水流無顏色。隨后室溫下風干，每孔各加200 μL無水乙醇，用200 μL移液器反復吹打，使生物膜均勻懸浮于無水乙醇中，隨即用酶標儀測定其在A=595 nm條件下的OD值。重復3次，取平均值。

1.2.4 電鏡實驗：①在生物膜的培養(yǎng)基里面放入0.5 cm×0.5 cm的玻璃板，細菌將在其上形成生物膜，培養(yǎng)24 h。②吸去2孔中的菌液，用鑷子取出蓋玻片，正面向上，濾紙置于蓋玻片一側(cè)吸去菌液，吸取無菌0.1 mol·L-1PBS滴于生物膜載體標本上，靜置8 min，吸水紙從邊緣吸去PBS，重復操作漂洗2遍去除浮游菌。③蓋玻片置于底面鋪有濾紙的6孔培養(yǎng)皿內(nèi)，37 ℃干燥1～2 h。④取一塊銅板，無水乙醇清洗表面，干燥后表面貼上導電膠。⑤將長有生物膜的蓋玻片貼于導電膠上（正面向上），在銅板上蓋玻片對應的位置進行編號。⑥打開鍍膜儀，進行60 s鍍膜。⑦開蓋取出銅板，上機進行電鏡掃描。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 用SPSS 17.0軟件對MIC數(shù)據(jù)資料進行Wilcoxon秩和檢驗，對不同組的生物膜吸光度OD值行獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗菌株對抗菌藥物的耐藥性 根據(jù)瓊脂稀釋法藥敏試驗結(jié)果，將9種臨床菌株分為MDR組和nMDR組。MDR組中，金黃色葡萄球菌對慶大霉素、莫西沙星、環(huán)丙沙星、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、青霉素G均表現(xiàn)為耐藥或中介；大腸埃希菌對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、氨曲南、頭孢唑啉、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、氨芐西林-舒巴坦、復方新諾明表現(xiàn)為耐藥或中介；肺炎克雷伯菌對慶大霉素、妥布霉素、氨曲南、頭孢曲松、頭孢唑啉、氨芐西林-舒巴坦表現(xiàn)為耐藥或中介。值得注意的是，本次實驗檢出15株廣泛耐藥（ext remely-drug resistant，XDR）肺炎克雷伯菌，藥敏試驗結(jié)果顯示XDR肺炎克雷伯菌對三、四代頭孢菌素、氟喹諾酮類藥物、碳青霉烯類藥物、氨基糖苷類藥物、β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合物等各類臨床藥物都表現(xiàn)出高水平耐藥。銅綠假單胞菌對亞胺培南、頭孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星表現(xiàn)為耐藥或中介；鮑曼不動桿菌對慶大霉素、妥布霉素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨芐西林-舒巴坦、復方新諾明表現(xiàn)為耐藥或中介。

2.2 單寧酸抗菌活性實驗結(jié)果 結(jié)果表明，單寧酸對臨床常見分離菌株有一定的抗菌活性，其對革蘭陽性菌的MIC均值小于對陰性菌的MIC均值，但革蘭陽性菌中，葡萄球菌屬的MIC值與腸球菌的MIC值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。另外，單寧酸對每種菌的MDR組和nMDR組的抗菌活性差異并無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明單寧酸對MDR也有很好的抗菌活性。見表1。

表1 單寧酸對9種臨床菌株的抗菌活性

2.3 單寧酸對生物膜的影響 從表2可以得出，各種臨床菌株均可以形成一定程度的生物膜，其中銅綠假單胞菌形成生物膜能力相對較強。與未加入單寧酸的OD595A相比，加入單寧酸后的OD595B明顯下降，且不論是MDR組和nMDR組，生物膜形成均減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明單寧酸可以抑制各類細菌生物膜的形成。

表2 單寧酸對9種臨床菌株生物膜抑制能力

2.4 生物膜掃描電鏡實驗 掃描電鏡下觀察可見，未加入單寧酸溶液時，細菌生物膜數(shù)量較多，縱橫交織，加入單寧酸溶液后，生物膜數(shù)量明顯減少，密度明顯下降（見圖1）。

圖1 掃描電鏡觀察單寧酸對生物膜的影響（×1 000）

3 討論

“超級細菌”泛指臨床上出現(xiàn)的多重耐藥菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、抗萬古霉素腸球菌（VRE）以及產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（KPC）等［7-8］。本研究篩選的多重耐藥菌表現(xiàn)出強勁的耐藥特性，MRSA菌株對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、安沙霉素類、林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)脂類、四環(huán)素類藥物中介或耐藥；大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌對β-內(nèi)酰胺類、青霉素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類、氟喹諾酮類等藥物中介或耐藥。另有15株肺炎克雷伯菌XDR菌株對除黏菌素和替加環(huán)素外的其他抗菌藥物全部耐藥。目前，新型抗菌藥物的研發(fā)速度遠遠不及多重耐藥菌株獲得耐藥性及克隆傳播耐藥基因的速度，使臨床醫(yī)務工作者即將面臨無藥可用的困境［2］。因此，加快研究利用中藥控制微生物感染已越來越受到重視。

許多中藥具有良好的抗菌作用，如傳統(tǒng)藥方中的兒茶膏、五倍子等，其主要有效成分為單寧酸，可以用來保護傷部，防止傷口被細菌感染［4，9］。本次實驗選取的菌株為臨床上常見的細菌，將所選取的細菌根據(jù)其耐藥性分為了MDR組和nMDR組。抗菌結(jié)果表明，單寧酸對MDR組和nMDR組的抗菌活性差異無統(tǒng)計學意義，表明我們可以利用單寧酸來治療臨床多重耐藥細菌所導致的感染。單寧酸對葡萄球菌屬的抗菌活性高于對革蘭陰性菌的抗菌活性，提示單寧酸可在控制葡萄球菌感染中發(fā)揮作用。

細菌生物膜是細菌生存的一種優(yōu)勢生活方式，細菌通過產(chǎn)生胞外基質(zhì)將細菌群體包裹起來，阻隔抗菌藥物及免疫因素的清除作用，細菌一旦形成生物膜，其耐藥性將會增加幾倍甚至幾十倍，且細菌能在被膜內(nèi)長期增殖，易導致慢性難治性感染［10］。而單寧酸可以很好地抑制細菌的生物膜形成，在0.08 mg·mL-1濃度下，細菌形成生物膜的數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。細菌生物膜數(shù)量減少，其對藥物的屏蔽作用減弱，有助于抗菌藥物直接作用于細菌，提高藥物的療效并減少耐藥。

綜上所述，單寧酸不僅可以抑制非多重耐藥細菌的生長，還能抑制多重耐藥細菌的生長，更明顯地降低細菌生物膜的形成。對其進行進一步深入的研究有助于為使用單寧酸作為臨床抗菌藥物提供實驗依據(jù)。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Antim icrobial activity of tannic acid and its effect on biofilm s of clinical isolates

YU Xiao1，HOU Yuanbo1，ZHOU Tieli2，CHEN Huale2，LI Bin2，DU Jia2，CAO Jianming1. 1.School of Laboratory Medicine and Life Science，Wenzhou Medical University，Wenzhou，325035； 2.Department of Laboratory Medicine，the Frist Affliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Ob jective：To analyze the antimicrobial activity of tannic acid against clinical isolates and its effect on biof lms. M ethods：Nine kinds of common clinical isolates，including Staphylococcus aureus，Staphylococcus epidermidis，Hemolytic staphylococci，Enterococcus faecalis，Enterococcus faecium，Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii were collected. All kinds of antim icrobial agents were evaluated w ith agar dilution method for the m inimal inhibitory concentrations （M IC）. According to the results of susceptibility testing，9 kinds of clinical isolates were divided into multidrug-resistant （MDR） group or non-multidrug-resistant group （nMDR）. Thirty strains from each group were random ly selected as experimental strains. Agar dilution method was used to detect tannic acid M IC of the strain. The difference of the 2 groups to refect the tannic acid antibacterial activities of common clinical isolates w as com pared. The effect on the biof lm formation was detected by adding tannic acid into the biof lm culture medium. Results：Tannic acid showed strong antibacterial activity to the 9 kinds of clinical isolates，antibacterial activity to the Staphylothermus bacteria was signif cantly greater than those for the other bacteria （P＜0.05）. Tannic acid could inhibit the bacterial biof lm formation. Conclusion：Tannic acid has antibacterial effect to common clinical isolates and can infuence the formation of biof lm.

tannin acid； multiple drug resistance； antim icrobial activity； biof lm

R378；R282

A DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2015.10.002

2015-03-30

國家自然科學基金資助項目（81171614）；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目（浙衛(wèi)發(fā)［2012］241號）。

尉驍（1990-），男，山西運城人，碩士生。

曹建明，教授，Emai l：wzc jming@163.com。