微波協同纖維素酶法提取薯蕷多糖工藝研究

龍菊++黃元射+何映霞

摘要：采用微波協同纖維素酶法提取薯蕷（Dioscorea opposita）多糖，并利用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗選出優化的組合因素。結果表明，最佳提取工藝條件為纖維素酶添加量0.20%、酶解時間70 min、酶解溫度45 ℃、pH 5.0、微波功率600 W、微波時間50 s，在此條件下，薯蕷多糖提取含量為30.25 mg/g，明顯高于其他提取方法。

關鍵詞：薯蕷（Dioscorea opposita）多糖；提取工藝；微波；纖維素酶；正交試驗

中圖分類號：Q539 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4266-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.041

薯蕷（Dioscorea opposita）又名山藥，產量高，營養成分全面，含有豐富的碳水化合物和蛋白質。薯蕷多糖是薯蕷中一種高效的活性成分，主要由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成[1-3]，具有增強免疫功能，降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等多種生理活性[4，5]。目前，薯蕷多糖的提取方法有微波輔助法、超聲波輔助法、水提取法、索氏提取法和纖維素酶解法等，但均存在提取時間較長、提取率較低等缺點[6-8]。為了進一步提高薯蕷多糖的提取率，縮短提取時間，本研究在單因素分析法的基礎上，采用多因素正交分析法，用微波技術協同纖維素酶法提取多糖，并對薯蕷多糖提取工藝進行優化，旨在為薯蕷多糖的提取提供一套快速、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

薯蕷：新鮮薯蕷購于貴州省安順市農貿市場。

主要試劑：纖維素酶、無水乙醇、濃硫酸、苯酚（分析純）；去離子水。

主要儀器：752型紫外-可見分光光度計、AB204-N型電子天平、DHG-9305AD型電熱恒溫干燥箱、EPP系列微量移液器、粉碎機、微波爐、旋轉蒸發器、離心機、HH-S型恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 薯蕷多糖提取工藝流程 精確稱取薯蕷粉1.0 g，加入去離子水10 mL，用600 W微波功率處理60 s，再加入0.2%纖維素酶，在50 ℃條件下酶解2 h，提取結束后抽濾提取液，濃縮到適當體積。具體工藝流程：薯蕷→干燥粉碎→稱量→去離子水溶解→微波水浴加熱→纖維素酶→滅活酶→水浴提取→離心取上清液→濃縮。

1.2.2 薯蕷多糖測定

1）采用苯酚-硫酸法測定吸光度。

2）檢測最大吸收波長。精確吸取0.5 mL葡萄糖標準品溶液，加去離子水至2.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，充分搖勻后室溫放置20 min。在波長400～700 nm范圍內掃描，用紫外分光光度計掃描光譜圖。

3）葡萄糖標準曲線繪制。精確稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖0.10 g，加入去離子水溶解，定容到100 mL，即得100 mg/mL葡萄糖標準溶液。取8支具塞試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL葡萄糖標準溶液，5.0 mL濃硫酸，1.0 mL 6%苯酚溶液，用去離子水定容至8.0 mL，靜置10 min，充分搖勻后室溫放置20 min，在最大波長處測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。薯蕷多糖含量的計算公式：多糖含量（mg/g）=[標準曲線計算樣品濃度值（mg）×樣品總體積（mL）]/[樣品的質量（g）×取樣體積（mL）]。

1.2.3 微波纖維素酶法提取薯蕷多糖的顯著作用試驗 分別精確稱取1.0 g薯蕷粉20份，每5份為一組，共分4組對薯蕷多糖進行提取，分別為：①水浸提法處理組。分別加入10 mL去離子水，60 ℃水浴提取2 h，提取結束后抽濾提取液，濃縮到適當體積。按照苯酚-硫酸法測定其吸光度，計算薯蕷多糖含量。②微波提取法處理組。分別加入10 mL去離子水，用600 W微波功率處理60 s，再按水浸提法處理組的方法進行操作。③纖維素酶法處理組。分別加入10 mL去離子水，加入0.2%纖維素酶，在溫度50 ℃條件下酶解1 h，再按水浸提法處理組的方法進行操作。④微波協同纖維素酶法處理組。分別加入10 mL去離子水，用600 W微波功率處理60 s，后再加入0.20%纖維素酶，在溫度50 ℃條件下酶解1 h，再按水浸提法處理組的方法進行操作。

1.2.4 纖維素酶法提取薯蕷多糖單因素試驗 在“1.2.3”中“③”的條件下，通過改變纖維素酶添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、酶解時間（20、30、40、50、60、70、80、90 min）、酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）、pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），考察各因素對薯蕷多糖提取率的影響。

1.2.5 微波法提取薯蕷多糖單因素試驗 在“1.2.3”中“②”的條件下，通過改變微波功率（160、320、480、600、720、840 W）和微波時間（10、20、30、40、50、60、70 s），考察2因素對薯蕷多糖提取率的影響。

1.2.6 薯蕷多糖提取率的正交優化試驗 在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗以纖維素酶添加量、酶解溫度、微波功率和微波時間，按照L16（44）設計4水平4因素試驗，試驗因素與水平見表1，共16個組合，3次重復，確定薯蕷多糖的最佳提取方法。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖最大吸收波長

采用苯酚-硫酸法，通過紫外分光光度計在400～700 nm波長范圍內掃描，由圖1可以看出，葡萄糖標準品在490 nm處有最大吸收波長，因此490 nm為葡萄糖吸光度的最佳檢測波長。

2.2 標準曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法，通過在最大吸收波長490 nm處測定葡萄糖吸光度，以葡萄糖濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖2，得到標準曲線方程：y=0.013 5x-0.258 3，R2=0.999 6。當測定多糖含量時，將吸光度代入標準曲線，即可求出所測溶液的多糖含量。

2.3 微波纖維素酶法提取薯蕷多糖的顯著作用試驗結果

由圖3可知，在薯蕷多糖的提取過程中，提取效率最高的是微波協同纖維素酶法處理組；其次為微波提取法處理組和纖維素酶法處理組；水浸提法處理組最低。說明與其他3種方法相比，微波協同纖維素酶法可提高薯蕷多糖的提取效率，且提取過程在1.5～2.5 h就可以基本完成整個試驗。

2.4 纖維素酶法提取薯蕷多糖單因素試驗結果

2.4.1 纖維素酶添加量對薯蕷多糖提取量的影響 由圖4可知，當纖維素酶添加量在0.15%～0.20%時，薯蕷多糖含量快速增加；當纖維素酶添加量為0.25%時，多糖含量變化比較平緩，變化不大；當纖維素酶添加量達0.30%時，多糖含量開始減少，其主要原因是多糖與纖維素酶分子達到飽和狀態，多糖提取量達到最大，因此纖維素酶添加量為0.20%時即可。

2.4.2 酶解溫度對薯蕷多糖提取量的影響 由圖5可知，隨著溫度升高，薯蕷多糖含量升高，其原因是溫度升高，多糖在水中的溶解度升高。當溫度超過45 ℃時，薯蕷多糖含量反而下降，主要原因是超過了纖維素酶的最適溫度。因此纖維素酶法提取薯蕷多糖最佳提取溫度為45 ℃。

2.4.3 酶解時間對薯蕷多糖提取量的影響 由圖6可知，纖維素酶在加熱后隨著時間延長，薯蕷多糖含量不斷提高；在50～70 min時，多糖含量變化不大。當提取時間超過70 min后，多糖含量逐漸減少。因此纖維素酶法提取薯蕷多糖的最佳提取時間在50～70 min。

2.4.4 pH對薯蕷多糖提取量的影響 由圖7可知，隨著pH增加，薯蕷多糖含量隨之增加， pH 5.0時，多糖含量達到最大值。當pH低于或高于5.0時，影響纖維素酶的活性，從而使多糖提取量降低，因此纖維素酶法提取薯蕷多糖的最適pH為5.0。

2.5 微波法提取薯蕷多糖單因素試驗結果

2.5.1 微波功率對薯蕷多糖提取量的影響 由圖8可知，隨著微波功率的升高，薯蕷多糖含量逐漸增加，當功率達600 W時，多糖含量達到最大值。這是由于功率的升高，加速多糖與水分子之間的運動，有利于多糖的提取，當微波功率超過600 W時，分子間的運動已達到極值，致使多糖提取量下降。因此選取微波功率600 W。

2.5.2 微波時間對薯蕷多糖提取量的影響 由圖9可知，隨著微波時間的延長，薯蕷多糖含量開始上升，當微波時間為30～60 s時，薯蕷多糖含量趨于平穩，變化不大。因此，微波提取時間應控制在30～60 s較好。

2.6 薯蕷多糖提取工藝的正交試驗結果

由表2可知，各因素對薯蕷多糖提取效果影響從大到小依次為纖維素酶添加量、微波功率、酶解時間、微波時間。由表3和圖10可知，微波功率和纖維素酶添加量對多糖提取影響極顯著，酶解時間有一定影響，微波時間對多糖提取的影響最小，因此最優工藝組合選取A3B2C4D3，即微波功率為600 W、纖維素酶添加量為0.20%、酶解時間70 min、微波時間50 s。在此條件下，薯蕷多糖含量為30.25 mg/g。

3 討論

本研究以薯蕷為研究對象，探討水浸提法、纖維素酶法、微波提取法、微波協同纖維素酶法4種方法提取薯蕷多糖的效果，結果表明微波協同纖維素酶法為最佳提取方法。利用單因素試驗和正交試驗確定微波協同纖維素酶法最佳提取條件為纖維素酶添加量0.20%、酶解時間70 min、酶解溫度45 ℃、pH 5.0、微波功率600 W、微波時間50 s，在此條件下，薯蕷多糖提取含量為30.25 mg/g。微波提取法和纖維素酶法所用微波功率、纖維素酶添加量過大或酶解時間過長均可能造成多糖有效成分分解，從而造成損失。本研究將微波提取法和纖維素酶法2種方法有機地結合起來，并利用正交試驗確定了最佳提取條件，其提取工藝具有操作簡單、速度快、效率高、質量好等特點，是一種有發展潛力的技術，為今后工業化提取多糖提供了很好的思路。

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