黃芪多糖的提取與抗氧化活性檢測(cè)

吳銘++韓丹++郭立泉

摘要：利用超聲波提取法從黃芪（Radix astragali）中提取多糖，應(yīng)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取條件，并采用超氧陰離子和DPPH自由基體系對(duì)黃芪多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，黃芪多糖提取的最佳條件為固液比1∶20、超聲提取時(shí)間12 min、超聲功率65 W、超聲提取溫度60 ℃，在此條件下，黃芪多糖提取率為8.75%。抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖具有較高的清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的活性。

關(guān)鍵詞：黃芪（Radix astragali）多糖；超聲波提取； 正交試驗(yàn)；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4263-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.040

黃芪（Radix astragali）是一種常見的中藥，屬于豆科黃芪屬，以根入藥，具有補(bǔ)氣升陽、脫毒、利水消腫、益胃固表等功效，是中國傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥[1]。現(xiàn)代醫(yī)藥研究發(fā)現(xiàn)，它能有效治療各種疾病，已被廣泛應(yīng)用于增強(qiáng)人體的免疫系統(tǒng)[1，2]。黃芪含有大量的生物活性成分，包括皂苷、黃酮和多糖[3]。多糖是黃芪已確定的主要生物活性成分之一。有研究表明，黃芪多糖有抗腫瘤、抗氧化、抗高血壓和免疫調(diào)節(jié)活性[4]。

黃芪多糖的提取方法是研究黃芪多糖活性的第一步，最常見的提取方法是利用傳統(tǒng)的溶劑萃取法從植物中提取多糖，但這些方法通常存在提取時(shí)間較長、提取溫度較高，且提取效率較低等缺點(diǎn)[5，6]。近年又發(fā)展了幾種從植物中提取多糖的新技術(shù)，包括超臨界流體萃取法，超聲波提取法和微波提取法。其中，超聲波提取法相比其他方法對(duì)植物材料的結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)損害更低[7]。利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)可以加強(qiáng)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，從而顯著提高提取效率[8，9]。由于這些原因，超聲波提取法被廣泛應(yīng)用于植物多糖的提取。本研究利用超聲波提取法從黃芪中提取黃芪多糖（RAP），應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，然后采用超氧陰離子自由基體系和DPPH自由基體系對(duì)黃芪多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

干黃芪購買于長春市草藥藥店。DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）、BHT（Butylated hydroxy toluene）、NADH（Nicotinamide adenine dinucleotide）和NBT（Nitroblue tetrazolium）為Sigma公司產(chǎn)品；其他的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 黃芪多糖的提取及單因素試驗(yàn)

將干黃芪磨成細(xì)粉，過40目篩。然后將干粉沉浸在去離子水中，調(diào)整固液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，m/V，g∶mL）、超聲提取時(shí)間（5、10、15、20、25 min）、超聲功率（40、50、60、70、80 W）和超聲提取溫度（30、40、50、60、70 ℃），收集提取液，于3 000 r/min離心10 min，取上清，按sevag法（氯仿/正丁醇=5∶1）脫蛋白質(zhì)，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮，取濾液加4倍體積的95%乙醇進(jìn)行沉淀，放置過夜，次日以3 000 r/min離心10 min，取沉淀用丙酮和乙醇清洗，得到粗多糖。多糖提取率的計(jì)算公式為：Y=m2/m1×100%，其中，Y表示多糖提取率（%），m1表示多糖的質(zhì)量（g），m2表示干黃芪樣品質(zhì)量（g）。

1.3 黃芪多糖提取正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)固液比、超聲提取時(shí)間、超聲功率和超聲提取溫度進(jìn)行4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.4 黃芪多糖的抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 DPPH自由基體系[10] 將黃芪多糖配成不同濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL）的待測(cè)液，另外用50%乙醇配置6 mg/100 mL的DPPH溶液。在試管中依次加入1 mL黃芪多糖不同濃度待測(cè)液和2 mL DPPH溶液，室溫放置（避光）反應(yīng)30 min，然后在517 nm處測(cè)定吸光度，以1 mL 50%乙醇加入到2 mL DPPH溶液中作為空白對(duì)照，以二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）作為參照。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，取其平均值。DPPH清除率計(jì)算公式如下：

SCDPPH=（1-■）×100%

式中，SCDPPH為DPPH的清除率；AS517 nm為樣品的吸光度；Ac517 nm為對(duì)照的吸光度。

1.4.2 超氧陰離子自由基體系 將黃芪多糖配成不同濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL）的待測(cè)液，取1 mL NTB溶液（156 μmol/L NBT溶于100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）、1 mL NADH溶液（468 μmol/L NADH溶于100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）和1 mL不同濃度黃芪多糖待測(cè)液，混勻后，加入100 μL的PMS溶液（60 μmol/L PMS溶于100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4），混勻后置于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，然后在560 nm處測(cè)定吸光度，以空白樣品作為對(duì)照，以BHT作為參照。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，取其平均值。超氧陰離子清除率計(jì)算公式如下：

SC■=（1-■）×100%

式中，SC■為超氧陰離子的清除率；AS517 nm為樣品的吸光度；AC517 nm為對(duì)照的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

在超聲提取時(shí)間為10 min、超聲功率為60 W、超聲提取溫度為50 ℃時(shí)，考察固液比對(duì)黃芪多糖提取的影響，結(jié)果（圖1A）表明，黃芪多糖提取的最佳固液比例為1∶20。在此基礎(chǔ)上，對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果（圖1B）表明，最適超聲提取時(shí)間為10 min。進(jìn)一步對(duì)超聲功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果（圖1C）表明，最適超聲功率為70 W。最后，在上述各最適條件的基礎(chǔ)上，考察超聲提取溫度對(duì)黃芪多糖的影響，結(jié)果（圖1D）表明，最適超聲提取溫度為60 ℃。

2.2 黃芪多糖提取的正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

黃芪多糖提取條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表2。由表2可知，4個(gè)因素對(duì)黃芪多糖提取率影響的主次因素為A、B、D、C，最佳提取條件組合是A2B2C1D2，實(shí)際試驗(yàn)組合中以A2B3C1D2提取率最高，方差分析可知B因素2水平與3水平差異不顯著，因此選取A2B3C1D2為最佳組合，即固液比為1∶20，超聲提取時(shí)間為12 min，超聲功率為65 W，超聲提取溫度為60 ℃，在此條件下，黃芪多糖的提取率為8.75%。

2.3 黃芪多糖的抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果

由圖2A可知，在濃度為0～0.20 mg/mL時(shí)，黃芪多糖對(duì)DPPH自由基的清除率比參照BHT弱，當(dāng)濃度為0.25～0.30 mg/mL時(shí)，黃芪多糖對(duì)DPPH自由基的清除率超過了BHT。由圖2B可知， 隨著濃度的增加，黃芪多糖和BHT對(duì)超氧陰離子自由基的清除率也隨之增強(qiáng)，且BHT對(duì)超氧陰離子的清除率一直高于黃芪多糖。總的來說，黃芪多糖具有較高的清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的活性，且對(duì)DPPH自由基的清除能力更強(qiáng)。

3 小結(jié)

超聲波提取法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于黃芪多糖的快速提取，由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，黃芪多糖最佳提取條件為固液比1∶20、超聲提取時(shí)間12 min、超聲功率65 W、超聲提取溫度60 ℃，在此條件下，黃芪多糖的提取率為8.75%。此外， 通過對(duì)黃芪多糖清除超氧陰離子自由基和DPPH自由基的研究表明，黃芪多糖具有清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的活性，黃芪多糖的抗氧化活性和抗氧化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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