胡蘿卜愈傷組織培養試驗及改進

羅文俊

【摘 要】在高中生物教學中，胡蘿卜愈傷組織培養試驗是一項重要的試驗教學，對胡蘿卜愈傷組織培養試驗進行研究和改進十分有必要。因此，本文對胡蘿卜愈傷組織培養試驗進行探討和分析，希望為相關人士提供有價值的參考，促進胡蘿卜愈傷組織培養試驗的不斷進步，不斷完善。

【關鍵詞】胡蘿卜；愈傷組織培養；試驗

1.植物組織培養研究及與高中生物學科的聯系

在生物學科重新進入高考以來，與植物組織培養息息相關的知識點如：細胞全能性、植物的激素調節、及植物組織培養技術歷年來都被列入高考大綱和考試說明，故在高中建立組培實驗室并開展組培實驗能為現階段高中生物教學，尤其是實驗教學提供第一手的可靠數據資料，對現階段高中生物教研來說是十分必要的。

1.1植物組織培養的定義

植物組織培養是指在無菌的條件下，將離體的植物器官、組織、細胞以及原生質體，培養在人工配制的培養基上，給予適當的培養條件，使其長成完整的植株。由于培養物是脫離植物母體，在玻璃瓶中進行培養，所以也叫做離體培養。其完整過程是：

2.胡蘿卜組織培養技術

2.1胡蘿卜組織培養實驗流程

MS母液配制→培養基配制及滅菌→愈傷組織誘導→遇上組織繼代培養→觀察記錄

2.2胡籮卜組織培養實驗用品

新鮮的胡籮卜莖段，超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、電熱爐、恒溫箱、pH值測試器、紫光燈、鑷子、燒杯、量筒、三角瓶、培養皿、濾紙、吸水紙、封口膜、MS固體培養基、Na2S2O3、1mol/LNaOH、2mg/L2，4-D溶液，1mg/L6-BA溶液、0.5mg/ml NAA溶液、15%鹽酸、3%次氯酸鈉、無水乙醇、0.1%升汞、蒸餾水。

2.3胡籮卜組織培養實驗準備工作

2.3.1母液配制

MS母液培養基配制：去植物組織培養MS固體培養基并加蒸餾水稀釋配置母液

植物激素配置：2，4-D：2mg/L、6-BA：1mg/L

注：2，4-D和NAA可先用酒精溶解在加蒸餾水定容，6-BA用濃鹽酸溶解后加蒸餾水定容。

2.3.2誘導培養基配制和滅菌

MS基礎培養基+0.1mg 6-BA+2mg 2，4-D

配制體積500ml，分裝為12瓶

取蒸餾水加入規定量的母液，植物生長調節物質和Na2S2O3，定容并檢測pH值并調節pH值為5.0左右。

注：在課本中要求的pH值為5.8—6.0，但是在具體的實驗過程中發現當pH值在該數值左右時外植體的褐話現象較為嚴重，故將pH值調低至4.5-5.0。培養基置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌后培養基在黑暗中放置3——5天觀察是否有微生物污染。

2.3.3其他所需滅菌物品：

培養皿，三角燒瓶，若干濾紙，無菌水，若干吸水紙，解剖刀柄，剪刀，鑷子等。

2.4胡籮卜組織培養方法

①用75%乙醇將凈化工作臺擦洗干凈，將接種所用的、工具、培養基等準備好放入工作臺。打開紫外燈和風機至少20分鐘后開始操作。

關閉紫外燈，點燃酒精燈。

②取胡籮卜一只，沖洗20分鐘，切取形成層部分約1cm3的塊狀，操作者手應用酒精消毒，在無菌操作臺上將胡籮卜段用酒精溶液消毒30秒，并立即用無菌水清洗2至3次，在用氯化汞溶液處理10——15分鐘，并立即用無菌水反復清洗2至3次。

③取一無菌培養基三角瓶：將消毒后的胡籮卜組織放入三角瓶中，每瓶3—5個，接10瓶，用封口膜封口，并用記號筆寫上接種日期。

④接種后的三角瓶置于培養室，20——25℃條件下，黑暗培養2-3周，直至愈傷組織形成。

2.4.1外植體褐變：

在具體的實驗過程中發現外植體的褐變現象較為嚴重，造成外植體死亡。其原因是由于在切割外植體時切割部位的細胞受傷使得植物體內處于分離狀態的酚類化合物與多酚氧化酶相遇，酚類化合物在多酚氧化酶的作用下形成醌類化合物和水，導致植物體其他酶系統失活，進而導致代謝系統紊亂，最終死亡。為了解決這一問題，在實驗中，我們盡量選取了幼年的植物，并在培養基中添加了抗氧化劑Na2S2O3作為防褐劑。同時，在酸性和低溫環境不利于醌類化合物的產生，故將pH值調低至4.5—5.0，溫度調低至20oC。另外光照環境也有利于醌類物質的形成，故將接種后的培養基置于無光條件下培養。

注意事項：

1.所有的組織培養實驗操作都必須在無菌條件下進行，所以我們必須時時注意實驗材料的無菌和消毒，實驗用具必須經過嚴格的滅菌，在滅菌的時候要特別注意必需等到燒熱的實驗儀器冷卻后再接觸材料，否則會把材料“燙傷”，所有的轉移材料的操作必須在無菌操作臺上進行。

2.接種時，動作要輕，力度適中。不要把接種的切塊壓入培養基里面，以致破壞培養基。同時要注意接種時瓶口應傾斜45度并在酒精燈火焰附近，以免手、鑷子上的贓物容易掉到三角瓶里。

3.培養基消毒滅菌時間不宜過長，也不可超過滅菌鍋規定的壓力范圍；當滅菌完成后，應切斷電源，待鍋內氣壓接近“0”時，方可打開放氣閥，取出培養基。

4.配制培養基時，要按照規定的用量認真計算并嚴格取出相應的母液。

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（作者單位：青海省油田第一中學）