液相色譜串聯質譜法在檢測雞肉中環丙沙星殘留的應用

呂小玲　管祖東　黃麗琴　李文跡　羅忠寶

（福建圣農發展股份有限公司技術中心　福建光澤　354100）

液相色譜串聯質譜法在檢測雞肉中環丙沙星殘留的應用

呂小玲管祖東黃麗琴李文跡羅忠寶

（福建圣農發展股份有限公司技術中心福建光澤354100）

建立了雞肉中環丙沙星的高效液相色譜串聯質譜測定方法，試樣經EDTA-Na緩沖鹽提取和凈化后，C18柱HPLC進行分離，多反應選擇離子檢測。方法的回收率和變異系數分別在90%～110%和3%～10%。該方法對雞肉中環丙沙星檢測限為1μg/kg。

液相色譜串聯質譜環丙沙星殘留

環丙沙星為合成的第三代喹諾酮類抗菌藥物，具廣譜抗菌活性，殺菌效果好，幾乎對所有細菌的抗菌活性均較諾氟沙星及依諾沙星強2～4倍，對腸桿菌、綠膿桿菌、流感嗜血桿菌、淋球菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌具有抗菌作用，全球廣泛用于治療人類及動物的各種細菌性疾病［1］。經研究發現由于濫用該藥導致廢水、生活垃圾等中該藥殘留濃度日益增加［2］，為此我國農業部、歐盟及日本等為控制合理使用該藥，對環丙沙星的最高殘留作了限定性要求［3］。檢測動物源食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方法有很多，目前，在雞肉產品的檢測中，常采用的方法是動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測---高效液相色譜法（農業部1025號公告14-2008）［4］。本研究建立了雞肉中環丙沙星的高效液相質譜聯用檢測方法，該方法準確、靈敏度高，適合雞肉中環丙沙星的快速確證分析，以便有效指導臨床用藥，確保食品安全。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑環丙沙星，含量99.0%，德國Dr. Ehrenstorfera公司。乙酸銨、甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，檸檬酸、EDTA-Na為化學純試劑。

1.2儀器與設備Agilent 6460液相色譜串聯質譜儀；吹氮濃縮裝置，北京八方；IKA MS 3 basic微型混合器；水浴恒溫振蕩器等實驗室常用設備。

1.3樣品前處理

1.3.1環丙沙星提取稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中。加入Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液，震蕩提取5 min，以6 000 r/min離心5min。殘留物用15mLNa2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液重復提取1次，合并2次上清液，用快速濾紙過濾，用一干凈50mL塑料離心管中收集濾液，定容至50mL，待凈化。

1.3.2凈化方法將提取液10 mL過艾杰爾PEP小柱（150mg/6mL）。a）6mL甲醇+6mL水活化；b）上樣；c）用6mL 5%甲醇淋洗；d）用6mL乙腈洗脫。準確移取洗脫液于氮氣流下吹至近干，用流動相定容至1mL，過0.22μm微孔濾膜，置2mL樣品瓶中。

1.4儀器參數與測定

1.4.1色譜測定條件a）色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18，3.5μm×100 mm×2.1mm（id）；b）流動相：0.1%甲酸乙腈：0.005mol/L乙酸銨水溶液=13∶87。c）柱溫：35℃；d）進樣量：5μL。e）接口及離子化方式：ESI+AJS，正離子檢測。干燥氣10 L/min，干燥溫度350℃，鞘氣12 L/min，鞘氣溫度250℃，氣體均為氮氣；電離電壓：4 000 V，各離子對的去簇電壓、碰撞能CE見表1。

表1　質譜參數

1.4.2質譜條件見表1。

2　結果與討論

2.1質譜條件的優化1μg/mL標準溶液在正離子模式下先進行一級質譜分析（Q1掃描），得到準分子離子峰 （M+1）即m/z332.0，優化去簇電壓。對m/ z332.0進行二級質譜分析，得到碎片離子信息，優化碰撞電壓，然后對離子源溫度、霧化氣、氣簾氣等進行優化。再以多反應監測（MRM）負離子模式優化去簇電壓、碰撞電壓、碰撞室入口及出口電壓等質譜參數。分別選擇豐度較強的2個子離子為特征離子，以母離子與子離子組成監測離子對，進行定性和定量分析。

2.2樣品前處理條件的選擇雞肉中富含蛋白和脂肪，基質干擾復雜，合適的前處理方法可以將待測組分與樣品雜質較好地分開。本試驗對傳統方法進行優化，根據待測組分的性質選擇EDTA-Na檸檬酸緩沖鹽溶液提取，本試驗對比3種不同pH（3.0、4.0、7.0）緩沖鹽以及乙腈、0.1%甲酸乙腈作為提取液的提取效率，結果表明（見表2），pH4.0緩沖鹽和乙腈提取較好，但有機試劑乙腈對人體及環境污染較大，故最終選用pH4.0緩沖鹽作為提取液。該方法提取效率高、雜質少、回收率高、前處理相對簡單，所采用有機試劑少，避免污染。

表2　不同提取液對雞肉樣品中添加環丙沙星提取回收率的影響（n=3）

2.3方法的定量限、回收率、重復性及線性范圍在以上確定的測定條件下，配制標準系列（n=6），分析化合物的濃度比為X軸，以分析物的峰面積比為Y軸作標準曲線。結果表明，環丙沙星濃度在1～20 μg/L時，線性關系良好，其相關系數和回歸方程為Y=2445.869948*X+573.162374，r2=0.992。在空白樣品中添加環丙標準溶液，進行3個水平濃度的添加回收試驗，每個濃度6個重復。結果見表3。

圖1　空白雞肉樣品離子圖

圖2　添加1μg/kg環丙沙星樣品離子圖

3　結　論

表3　雞肉樣品添加回收率及精密度測試結果（n=6）

雞肉中的環丙沙星殘留可利用高效液相色譜串聯質譜法進行快速測定，該方法非常適合于雞肉中環丙沙星的快速定量定性分析，在1.0～100μg/kg添加水平范圍內的平均回收率為92%～105.2%，相對偏差為3.8%～9.4%，方法檢測限等指標滿足國內外檢測的相關要求。

［1］Bhandari A，Close L I，Kim W J，et al.Occurrence of ciprofloxacin，sulfamethoxazole，and azithromycin in municipal wastewater treatment plants［J］.Practice Periodical of Hazardous，Toxic，andRadioactiveW asteManagement， 2008，12（4）：275-281.

［2］Carmosini N，Lee L S.Ciprofloxacin sorption by dissolved organic carbon from reference and bio-waste materials［J］. Chemosphere，2009，77（6）：813-820.

［3］農業部.中華人民共和國農業部公告第235號［EB/OL］. （2002-12-24）.http：//yz.hz-agri.gov.cn/uploadFiles/2005-10/1130221564406.doc

［4］中華人民共和國農業部.動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測：高效液相色譜法［S］.農業部1025號公告-14-2008.

Determ ination of the residues of ciprofloxacin in chicken by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Lv Xiaoling Guan Zudong Huang Liqin LiWenji Luo Zhongbao
（Fujian sunner development CO.，LTD.，Guangze 354100）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）method was developed for the quantitative determination of Ciprofloxacin respectively in the chicken.The ciprofloxacin in chicken were deproteinated with EDTANa Mcllvaine buffer followed by liquid-liquid extraction.Further clean-up was performed by solid phase extraction（SPE）through mixed mode columns（PEP-2 SPE）.The separation of the compounds was carried on a Agilent Eclipse Plus C18 column（C18，3.5 μm×100mm×2.1mm（id）by a gradient elution using 0.1%formic acid acetonitrile and 0.1%formic acid water asmobile phases.The analyzes were detected by tandem mass spectrometry in multiple reaction monitoring（MRM）mode with negative electrospray ionization.The ciprofloxacin quantified by internal standard method.The linear ranges were 1.0～20.0μg/L and the correlation coefficients were not less than 0.992.The average recoveries and relative standard deviations ranged from90%～110%and 3%～10%respectively at the spiked levels of 1，2 and 10μg/kg for the bothmarkers.The limit of quantitation（LOQ）was 1μg/kg.Themethod is sensitive，accurate and suitable for the determination and confirmation of chloramphenicols in chicken and eggs.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）ciprofloxacin residue chicken

A

1003-4331（2015）02-0018-03

福建省區域科技重大項目（2012N 3011）“規模化白羽肉雞肉品生產獸藥殘留監控技術的研究與應用”資助。