牡蠣粗多糖對免疫應激大鼠TLR-4 m RNA表達水平的影響

岳　剛　黃志堅張儒雅　許翔宇

（福建農林大學動物科學學院　福建省動物工程實驗室，福州　350002）

牡蠣粗多糖對免疫應激大鼠TLR-4 m RNA表達水平的影響

岳剛黃志堅*張儒雅許翔宇

（福建農林大學動物科學學院福建省動物工程實驗室，福州350002）

目的：試驗目的是研究牡蠣粗多糖對脂多糖（LPS）刺激雄性大鼠產生的免疫應激是否產生緩解效果。方法：選擇30只成年SD大鼠，按照體重靠近的原則，隨機分成5個試驗組（即空白對照組，免疫應激對照組，牡蠣粗多糖高劑量組、牡蠣粗多糖中劑量組、牡蠣粗多糖低劑量組），每組6只雄性大鼠。空白對照組和免疫應激對照組飼喂基礎日糧，牡蠣粗多糖高、中、低劑量組為基礎日糧添加0.9%、0.6%、0.3%牡蠣粗多糖。飼喂28 d后，免疫應激對照組、牡蠣粗多糖高、中、低劑量組按體重計算腹腔注LPS 100μg/kg，空白對照組則注射相等量的生理鹽水。于注射3 h后采血，剖檢取肝臟、脾臟、腎上腺、淋巴結，用RT-PCR檢測TLR-4 mRNA的相對表達量。結果：牡蠣粗多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組和空白對照組肝臟、脾臟、腎上腺和淋巴結TLR-4mRNA的相對表達量與應激對照組相比出現極顯著性降低（P＜0.01），而牡蠣粗多糖中劑量組、高劑量TLR-4mRNA的相對表達量較低劑量組更趨于生理狀態下空白對照組的相對表達量。結論：LPS作為免疫原可以引起雄性大鼠產生免疫應激反應，在基礎日糧中添加牡蠣粗多糖可以緩解免疫應激，且日糧中的添加量為0.6%～0.9%時，緩解效果較好。

牡蠣粗多糖免疫應激TLR-4大白鼠

狹義的免疫應激反應是說在動物接種疫苗后，動物所產生免疫應答的同時，其自身也受到一定范圍的損傷，廣義的“免疫應激”又稱免疫激發，這包括亞健康狀態下動物體受到的各種病原侵害［1］。袁志航等研究表明［2］，當動物機體受到免疫應激后體內IL-1、IL-6、TNF等發生改變使得動物機體食欲減退或者廢絕，蛋白質轉換速率增高，氮排泄增高，外周蛋白的分解加速，骨骼肌蛋白的沉積減少，肝急性期蛋白的合成數量增高，同時介導動物機體的脂肪代謝。胡婷等研究表明，從牡蠣中提取的多糖具有明顯的降血壓，抗凝血，抗血栓，提高機體的免疫功能和抗白細胞下降等作用［3］。陳艷輝等研究表明，牡蠣多糖對鼻咽癌細胞CNE-1和血管內皮細胞的生長增殖具有抑制作用［4］。而李江濱等研究表明牡蠣多糖能明顯抑制MDCK細胞培養流感病毒的增殖，對利巴韋林抗流感病毒具有相加效應［5］。現在動物免疫應激方面面臨著諸多的問題，如如何評估動物應激的行為學和生理學指標與動物福利之間的關系，動物自身擁有有很復雜的行為和生理學機制用來對付免疫應激，這種生物學變化在何時影響到動物機體健康，威脅到動物的繁衍等將作為我們今后很長一段時間需要研究的方向［6］。研究牡蠣多糖對免疫應激大鼠的作用將有效的解決以上幾個難題。

1　材料和方法

1.1動物分組與設計選取30只雄性成年的大白鼠，平均體重在223.48 g，按體重靠近的原則，隨機分成空白對照組，應激對照組，牡蠣粗多糖高、中、低劑量組，每組6個重復。空白對照組和免疫應激組飼喂基礎日糧，牡蠣粗多糖高、中、低劑量組分別喂含有0.9%、0.6%、0.3%牡蠣粗多糖的基礎日糧，試驗期為28 d。試驗前12 h斷水斷料，試驗各組按每千克體重腹腔注射LPS 100μg，空白對照組注射等量生理鹽水。于注射3 h后采血，剖檢。

1.2材料LPS（大腸桿菌血清型O55：B5，Sigma公司），ELISA試劑盒 （Cusabio Biotech Co.，LTD），Trizol，Prime Script？RT reagent Kit Perfect Real Time （TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd），熒光試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司），瓊脂糖。

1.3測定方法

1.3.1樣品處理采取的血液室溫靜置后，以3 000×g離心10min，分離血清置于-20℃保存；采血后隨機取1只剖檢，取淋巴結，腎上腺，脾臟，肝臟等，用錫紙包裹，液氮運輸，-40℃保存，待測TLR-4mRNA的表達水平。

1.3.2引物的設計根據GenBank中收錄號為NM_214379和 DQ845171.1的基因序列，利用primer5.0各設計引物一對，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

β-actin（擴增長度為 300）：Sense primers∶5' TGCGGAAGGATCATTAACGGA 3'；

Anti-sense primers∶5'AGTAGGAGAGGAGCGAGCGACC3'。

TLR 4（擴增長度為 101）：Sense primers∶5' TATCCAGAGCCGTTGGTGTATC3'；

Anti-sense primers∶5'CCACTTTCTCAAGGACAATGAAG3'。

1.3.3總RNA的提取和cDNA合成按照傳統方法提取總RNA［7］，并檢測總RNA的濃度和純度。cDNA的合成按照Prime Script？RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒說明書進行。

1.3.4熒光定量PCR反應采用Bioteke Power 2× SYBR Real-time PCR Premixture熒光定量試劑盒，用CFX-96型Real-Time PCR擴增儀對反轉錄產物進行擴增。反應體系：10μL的2×Premix，濃度為10μmol/L的上下游引物各 0.4μL，模板 DNA 2μL，滅菌蒸餾水7.2μL，終體積為20μL。反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃變性30 s，40個循環。

2　結　果

從圖1可知，與空白對照組相比，應激對照組肝臟、脾臟、腎上腺和淋巴結中TLR-4 mRNA的相對表達量極顯著性升高（P＜0.01），而牡蠣粗多糖低劑量組TLR-4 mRNA的相對表達量在淋巴結、脾臟中顯著性降低（P＜0.05），在肝臟和腎上腺中極顯著降低（P＜0.01）；牡蠣粗多糖中劑量組TLR-4 mRNA的相對表達量在淋巴結、脾臟中顯著性降低（P＜0.05），在肝臟和腎上腺中極顯著性降低（P＜0.01）；牡蠣粗多糖高劑量組TLR-4 mRNA的相對表達量在淋巴結和脾臟中顯著性降低（P＜0.05），在肝臟、腎上腺中極顯著性降低（P＜0.01）。與應激對照組相比，牡蠣粗多糖高，中，低劑量組TLR-4 mRNA在肝臟、腎上腺、淋巴結和脾臟中的相對表達量極顯著性降低（P＜0.01）。其中，當劑量為 0.6%～0.9%時 TLR-4mRNA相對表達量在肝臟、腎上腺、淋巴結和脾臟中更接近于空白對照組。

3　討　論

圖1　TLR-4在免疫器官中m RNA的相對表達量

劉士強［8］研究表明，LPS應激對斷乳大鼠的免疫功能和血液生化指標可造成一定的影響。查閱相關文獻表明，現在對于多糖可以緩解免疫應激的研究主要以血液炎性細胞因子和激素水平方面為主，而對于Toll樣受體4（TLR-4（和免疫應激方面的研究較少。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR（是模式識別受體家族中的一員。TLR4作為首先被發現同時也是最重要的TLR，不僅識別外源性配體如內毒素（LPS（、磷壁酸、肽聚糖等，還能識別內源性配體如熱休克蛋白60、70，硫酸肝素片段等［9］。TLR-4不僅參與了原微生物介導的炎癥反應，有研究發現其在組織或器官IR損傷的炎癥反應中也發揮巨大作用［10］。現在在TLR-4的構造以及其所參與促炎反應、促進免疫細胞成熟分化及調節免疫應答等方面的研究比較清晰，TLR-4介導的信號轉導途徑包括髓樣分化蛋白88（Myd88（依賴性和非依賴性，前者經過一系列的級聯反應后導致NF-κB的活化，從而產生大量致炎因子如TNF-ɑ、IL-1、IL-6等［11-12］。后者主要是誘導干擾素-β和干擾素誘導基因的表達，并引起NF-κB的晚期活化，最終導致干擾素-β和干擾素誘導蛋白10等致炎因子的釋放［13-14］。肝臟是機體內主要的解毒器官，聚集了大量的單核-巨噬細胞，對LPS刺激后所產生的炎癥反應強烈［15］。腎上腺作為機體內重要的內分泌器官，由皮質和髓質構成，皮質可以分泌皮質醇，測量其中的皮質醇含量可以反映大鼠是否處于應激狀態。脾臟和淋巴結是作為機體內比較大的免疫器官，是機體免疫應答發生的場所，對LPS刺激導致的免疫應激反應強烈，研究TLR-4在胸腺、脾臟和淋巴結中的表達量一定程度上可以反映大鼠在經過LPS刺激后機體內的免疫應激狀況。與前者相對應正常生理狀態下，動物機體存在著各種TLRs的負調控機制，從而維持免疫反應的平衡。機體為了保證TLRs介導正確的免疫應答，存在精確的負調控機制，及時抑制TLRs信號，維持機體的免疫平衡［16］。

試驗發現，在免疫應激對照組中，TLR-4mRNA在肝臟、腎上腺、淋巴結和脾臟等部位均有表達，且免疫應激導致這些器官在3 h內的TLR-4 mRNA相對表達量極顯著性上升。這與杭濤等［17］的研究一致，即小鼠失血后1 h心肌TLR2及TLR4基因的表達水平增高。與之相對比，飼喂牡蠣粗多糖的免疫應激組在肝臟、腎上腺、淋巴結和脾臟中TLR-4 mRNA的相對表達量與應激對照組比較極顯著性降低，這與孫雪芳等的研究有一定的相似性，黃芪多糖能有效抑制LPS誘導的心肌肥大，表現為蛋白含量降低，體積減小；并能有效減少炎癥反應，表現為TLR-4mRNA表達降低［18］。從試驗結論可以看出，牡蠣粗多糖可以通過誘導動物機體負反饋調控TLR-4mRNA的表達和其炎性細胞因子的釋放，從而防止炎性細胞因子過高對動物機體造成不可逆的損傷，從而緩解機體的免疫應激。由圖1各組試驗數據得出，高劑量組與中劑量組TLR-4的相對表達量更趨于生理狀態下空白對照組的相對表達量，由此可以得出牡蠣粗多糖緩解免疫應激的最佳劑量處于0.6%～0.9%。

4　結　論

在大鼠基礎飼糧中添加牡蠣粗多糖對于大鼠由脂多糖（LPS）刺激引起的免疫應激有緩解作用，經過試驗數據分析可知當添加量在0.6%～0.9%時，可以表現出較好的緩解效果。

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Effects of oyster crude polysaccharides on TLR-4mRNA expression after immunological stress

Yue Gang Huang Zhijian*Zhang Ruya Xu Xiangyu
（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University National Students'Innovation and Entrepreneurship Training Program，Fuzhou 350002）

Objective：Trial is to study oyster polysaccharide on lipopolysaccharide（LPS）stimulation ofmale rats to produce immune effects of stress are generated ease.Method：Select30 adult SD rats，in accordance with the principles ofweightnear random ly divided into five experimental groups（ie，the control group，the control group immune stress，oysters polysaccharide of high-dose group，middle dose group polysaccharide oysters，oyster polysaccharide low dose group）6 male rats.The control group and the control group fed the basal immunological stress diet，oysters polysaccharide of high，medium and low dose groups based diet supplemented with 0.9%，0.6%，0.3%oyster polysaccharide.After feeding 28 d，immune stress control group，oysters polysaccharide of high，medium and low dose groups according to body weightby intraperitoneal injection LPS 100μg/kg，blank control group were injected with an equal volume of saline.3 h after injection blood，necropsy take the liver，spleen，adrenal gland，lymph nodes，the relative expression by RT-PCR detection of TLR-4 mRNA.Result：High-dose group polysaccharide oysters，middle dose group and low dose group and the control group liver，spleen，adrenal glands and lymph nodes relative expression of TLR-4mRNA and stress compared to the control group had significantly decreased（P＜0.01），while the oyster polysaccharide dose group，high dose TLR-4mRNA expression levels relative to the lower dose group tends to bemore relative expression of the physiological state of the control group.Conclusion∶LPS as immunogens can cause an immune stress response in male rats，based diets can alleviate oysters polysaccharide immune stress and dietary dosage of 0.6%to 0.9%，the effect ismore ease Okay.

Oyster polysaccharides immunological stress TLR-4 Rat

A

1003-4331（2015）02-0008-04

2013年國家級“大學生創新創業訓練計劃”項目資助。

岳剛（1991-），男，甘肅榆中人，本科生，動物醫學專業。E-mail：nongdayuegang@163.com。

黃志堅（1963-），男，福建惠安人，教授，從事動物疾病防治與保健。E-mail：huangzj1999@sina.com。