一測雙評法測定咳特靈膠囊中牡荊苷與異牡荊苷的含量△

員榮，孫麗麗，楊立偉*

(1.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省食品藥品檢驗所，廣東 廣州 510180)

·中藥工業(yè)·

一測雙評法測定咳特靈膠囊中牡荊苷與異牡荊苷的含量△

員榮1，2，孫麗麗2，楊立偉2*

(1.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省食品藥品檢驗所，廣東 廣州 510180)

目的：建立咳特靈膠囊一測雙評法，并進(jìn)行方法學(xué)考察。方法：以牡荊苷為研究對象，建立牡荊苷與異牡荊苷的相對校正因子(RCF)，并利用校正因子對異牡荊苷進(jìn)行含量測定，實現(xiàn)一測雙評；采用外標(biāo)法測定牡荊苷與異牡荊苷的含量，比較計算值與實測值間的差異。結(jié)果：在一定線性范圍內(nèi)，牡荊苷與異牡荊苷的RCF為0.9，不同廠家的咳特靈膠囊中兩個成分的計算值與實測值無明顯差異。結(jié)論：本研究建立的一測雙評法準(zhǔn)確、可行，可為中藥制劑多指標(biāo)質(zhì)量評價提供新思路。

一測雙評；校正因子；高效液相色譜；牡荊苷；異牡荊苷

咳特靈膠囊現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第十四冊，小葉榕干浸膏為本品的主要成分之一，其為桑科植物細(xì)葉榕FicusmicrocarpaL.f.的干燥葉加工制成的提取物。房志堅等[1]對小葉榕葉的水提物進(jìn)行研究，結(jié)果表明小葉榕葉中含有牡荊苷和異牡荊苷等黃酮類化合物；李彥文[2]對小葉榕進(jìn)行化學(xué)成分研究，結(jié)果表明小葉榕中含有牡荊苷和異牡荊苷。現(xiàn)代藥理學(xué)表明：牡荊苷和異牡荊苷對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有較強的抑制作用，有中等的抗副流感病毒(Para 3)活性[3]。因此，測定牡荊苷和異牡荊苷的含量對于控制咳特靈膠囊質(zhì)量具有重要意義。但異牡荊苷對照品價格昂貴且來源有限，因此本研究采用一測雙評法[4]測定其藥效成分，確定牡荊苷與異牡荊苷的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，實現(xiàn)用一個對照品同步測定兩個藥效成分的含量[5]。一測多評理念提出之后，許多實驗室及研究機構(gòu)對此法在藥材及制劑中的應(yīng)用進(jìn)行研究。目前，以一測多評法測定黃連中目標(biāo)成分的含量已收載入《中華人民共和國藥典》，但此法在中藥制劑中的應(yīng)用尚未有品種收載。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀系統(tǒng)(LC-20AT泵、CTO-15C柱溫箱、SIL-20AC自動進(jìn)樣器、SPD-M20Ae二極陣列管檢測器)；KQ-300DA超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司)；純水儀(美國Millipore公司)；AG135、AEG-120G型電子天平(德國AEG工業(yè)技術(shù)公司)。

1.2 試藥

牡荊苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111687-220501)；異牡荊苷對照品(供含量測定用，含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：YM0506HA14)。

咳特靈膠囊由廣東一力集團(tuán)制藥公司、廣州白云山制藥股份有限公司、廣州白云山制藥總廠、廣東一力羅定制藥有限公司、廣州市花城制藥廠提供。見表1。

表1 收集樣品情況

2 方法與結(jié)果

2.1 一測雙評方法學(xué)考察

2.1.1 供試品溶液的制備 取咳特靈膠囊(批號：5140303)10粒，精密稱定，研細(xì)，取1.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密量取牡荊苷、異牡荊苷對照品適量，用70%甲醇溶液配成質(zhì)量濃度分別為10.61、14.40 μg·mL-1的牡荊苷和異牡荊苷對照品溶液。

2.1.3 陰性對照品溶液的制備 取小葉榕干浸膏陰性樣品1.4 g，照供試品溶液的制備方法，制成陰性對照溶液。

2.1.4 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A，0.05%磷酸溶液為流動相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為335 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按牡荊苷峰計算應(yīng)不得低于3000。在上述色譜條件下，各組分分離度較好，見圖1。

表2 擬定的流動相梯度表

A.對照品；B.樣品；C.陰性對照品；1．牡荊苷；2.異牡荊苷。圖1 咳特靈膠囊樣品及對照品色譜圖

2.1.5 線性考察 精密稱取牡荊苷對照品8.31 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0.083 1 mg·mL-1的牡荊苷儲備液；精密稱取異牡荊苷對照品8.40 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0.084 0 mg·mL-1的異牡荊苷儲備液。取上述牡荊苷、異牡荊苷對照品儲備液各2 mL，加入25 mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.006 648、0.006 720 mg·mL-1的牡荊苷、異牡荊苷混合對照品溶液。分別進(jìn)樣5、10、40、60、100 μL。分別以牡荊苷和異牡荊苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程，異牡荊苷：Y=2.783×107X-1800，r=0.999 6；牡荊苷：Y=2.573×107X-1.176×105，r=0.999 8，結(jié)果表明牡荊苷和異牡荊苷分別在0.033 2～0.636 6 μg和0.033 6～0.672 0 μg線性關(guān)系良好。

2.1.6 校正因子的計算 以牡荊苷為內(nèi)標(biāo)，計算牡荊苷對異牡荊苷的相對校正因子，計算公式：

式中A為組分峰面積，C為組分濃度，i為內(nèi)標(biāo)物，S為其他組分，計算結(jié)果見表3。

表3 相對校正因子的計算

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一供試品(批號：5140303)，精密稱取6份，按擬定方法測定，結(jié)果表明牡荊苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.260 3 mg·g-1，RSD為1.5%；異牡荊苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.580 8 mg·g-1，RSD為2.3%，說明本方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品(批號：5140303)溶液，分別在1、3、6、9、12、16、24 h，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果牡荊苷峰面積的RSD為2.0%，異牡荊苷峰面積的RSD為2.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.9 回收率考察 分別取已測得含量的供試品(批號：5140303，牡荊苷0.260 3 mg·g-1，異牡荊苷：0.580 8 mg·g-1)0.4、0.7、1.4 g各4份，精密稱定，分別加入2.1.2項下的牡荊苷對照品儲備液1、1.5、3 mL和異牡荊苷對照品溶液2、3、6 mL，按2.1.1項下方法制備溶液，按擬定的方法進(jìn)行測定，記錄色譜峰峰面積并計算回收率，結(jié)果表明，本方法對牡荊苷及異牡荊苷含量測定準(zhǔn)確性較好。詳見表4～5。

表4 牡荊苷回收率結(jié)果

表5 異牡荊苷回收率結(jié)果

2.2 校正因子重現(xiàn)性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 取2.1.5項下混合對照品溶液，進(jìn)樣5、10、40、60、100 μL，按2.1.6項下方法計算異牡荊苷的相對校正因子。

本試驗考察了Waters 2695、島津LC-2010A HT兩種高效液相色譜儀和Welch XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Purospher STAR RP-18 endcapped(250 mm×4.6 mm，5μm)、Sepox Bio-C-18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器及色譜柱的相對校正因子比較

2.2.2 實驗室考察 采用一測雙評法，經(jīng)兩個實驗室進(jìn)行復(fù)核試驗。實驗室1所得結(jié)果為0.893，實驗室2所得結(jié)果為0.905。

2.2.3 待測組分色譜峰定位 利用相對保留時間定位，分別考察了不同柱溫、不同色譜柱及不同儀器等條件下，異牡荊苷峰相對于牡荊苷峰的保留時間。結(jié)果表明，在以上不同條件下，保留時間比較穩(wěn)定，說明以相對保留時間定位是可行的，結(jié)果見表7。

表7 相對保留時間的考察

2.3 一測雙評法與外標(biāo)法結(jié)果比較

對收集的24批樣品分別按照外標(biāo)法和一測雙評法進(jìn)行測定，結(jié)果異牡荊苷的含量結(jié)果相對偏差均不超過2.2%。說明本研究選擇Rf異/牡為0.90是合理的，對測定結(jié)果的影響不大，見表8。

表8 兩種方法測定異牡荊苷的比較

2.4 含量測定

按擬定的含量測定方法對收集的5個生產(chǎn)廠家24批樣品分別進(jìn)行測定，結(jié)果見表9。24批樣品中牡荊苷和異牡荊苷含量之和的均值為0.837 mg·g-1。

2.5 限度制訂

所測的24批樣品中牡荊苷和異牡荊苷含量之和的均值為0.837 mg·g-1，即0.42 mg/粒(每粒膠囊0.5 g，分別稱取20粒，記錄其各自總重量，然后取出內(nèi)容物，再稱量膠囊殼的重量，然后計算每粒的凈重量，并求得平均值)。由于小葉榕藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無牡荊苷和異牡荊苷含量測定項，故擬定本品含量測定限度以所收集到的樣品測定結(jié)果的平均值(0.42 mg/粒)為依據(jù)。考慮到藥材來源及大生產(chǎn)等可能產(chǎn)生的差異，筆者將所測定結(jié)果的平均值下調(diào)30%，擬定本品限度。咳特靈膠囊含小葉榕浸膏，以牡荊苷(C21H20O10)和異牡荊苷(C21H20O10)的總量計，不得少于0.28 mg/粒。

表9 供試品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1本試驗比較了不同提取溶劑、提取方式、提取時間、溶劑用量等，最后確定以70%甲醇25 mL超聲30 min，此條件下提取較為完全，且方法簡便。

3.2牡荊苷與異牡荊苷均為咳特靈膠囊的藥效成分，異牡荊苷價格昂貴，較難得到，且牡荊苷與異牡荊苷為同分異構(gòu)體，因此以牡荊苷為內(nèi)參物計算異牡荊苷的含量是合理的。

3.3 創(chuàng)新點

在進(jìn)行一測雙評研究時，筆者建議盡量使各物質(zhì)的濃度一致，以減少各對照品濃度不一致造成的誤差。本研究，配成濃度比為1∶1的混合對照品，在保證兩者濃度相同的情況下，相對校正因子仍與理論值1差別較大，因此，相對校正因子與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系有待進(jìn)一步研究；同時建議在進(jìn)行一測多評計算相對校正因子時，將各對照品的濃度比配成1，此項建議并未見此領(lǐng)域研究者提出。

3.4對于藥物的整體質(zhì)量評價，多采用指紋圖譜法，而一測雙評法是在藥效成分明確基礎(chǔ)上的定量分析。目前，一測雙評法多用于藥材中藥效成分的研究，已有很多文獻(xiàn)報道在其中藥制劑中的應(yīng)用，《中華人民共和國藥典》中尚無關(guān)于中藥成藥的記載。

[1] 房志堅，戴臻，李書淵.小葉榕葉HPLC指紋圖譜的研究[J].中藥材，2008(10)：31-35.

[2] 李彥文.小葉榕化學(xué)成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

[3] 張雪，徐道華.牡荊苷的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013(35)：35-38.

[4] 王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術(shù)指南[J].中國中藥雜志，2011(6)：657-658.

[5] 陳建偉，李祥，步達(dá)，等.一測多評法及其在中藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用[C].//中華中醫(yī)學(xué)會中藥分析分會第五屆學(xué)術(shù)交流會論文集.沈陽：中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥分析分會，2012：20-23.

SimultaneousDeterminationofVitexinandIsovitexinofKetelingCapsulesbyDouble-ComponentsAssaywithSingleMarker

YUANRong1，2，SUNLili2，YANGLiwei2*

(1.GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；2.GuangdongInstituteforFoodandDrugControl，Guangzhou510180，China)

Objective：To establish a quantitative assay of double-components by single-marker for determination of two components in Keteling capsules and and conduct the method validation test.Methods：Vitexin was selected as an internal reference substance，RCF of isovitexin was calculated.The contents of two components were determined by both external standard method and Double-Components Assay by Single Marker.The validity of the QAMS method was evaluated by comparison of their quantitative results of both methods.Results：RCF of isovitexin with reference to vitexin were 0.90 and the quantitative results of both external standard method and QAMS had no significant difference.Conclusion：The established method is accurate and feasible，and can provide a new mind for the quality assess of preparation of Chinese traditional medicine.

QAMS；RCF；HPLC；Vitexin；Isovitexin

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.018

2014-11-26)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81102146)

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楊立偉，主任藥師，博士，研究方向：中藥質(zhì)量控制與快速檢測；E-mail：yangliwei33@aliyun.com