玻璃化超低溫對紅肉臍橙愈傷組織存活率的影響

許勤勤 童玲 王艷芳

摘要：本研究探討了玻璃化超低溫處理對紅肉臍橙愈傷組織存活率的影響。

關鍵詞：紅肉臍橙;玻璃化超低溫;存活率

中圖分類號： ?S666;Q813 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼： ?A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI編號： ? 10.14025/j.cnki.jlny.2015.18.027

紅肉臍橙（Citrus sinensis L.cv. red flesh navel orange）原名 Cara Cara，20 世紀 80 年代發現于委內瑞拉，是華盛頓臍橙的天然芽變，到目前為止，它是在甜橙中發現的唯一果肉呈粉紅色或紅色的臍橙品種[1]。紅肉臍橙果實閉臍，果皮橙紅，著色均勻，果肉內質，果汁多，酸甜適口，有特殊香味。紅肉臍橙豐產性能好，品質優良，耐儲存，極具市場潛力。

玻璃化（vitruification）超低溫保存植物種質資源始于20世紀80年代，Uagami等首先采用此法嘗試保存石刁柏懸浮細胞和體胚[2]，隨后Sakai等做了進一步改進。該方法將細胞或組織在冷凍前，用植物玻璃化溶液（plant vitrification solution，PVS）[3]處理，使細胞脫水并使DOMS進入細胞，使細胞在-196℃下，不形成冰晶而成玻璃化狀態[4]。

在本研究中，紅肉臍橙愈傷組織首先經過PVS處理后，轉入到液氮中保存100分鐘，用洗脫液洗去PVS后，然后檢測細胞存活率。

1 材料與方法

1.1供試材料

1.1.1 柑橘品種 紅肉臍橙愈傷組織由華中農業大學作物遺傳改良實驗室提供，河南大學農業生物技術研究所保存。

1.1.2 ?所用試劑 PVS（Plant vitrifition solation ）：30%的甘油，15%的乙二醇，15%的DMSO，0.4mol/L蔗糖的液體MS培養基。

洗脫液：1.2mol/L蔗糖的MS溶液，1%TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液，0.1mol/L，pH=7的磷酸緩沖液。

1.2方法

1.2.1紅肉臍橙愈傷組織的液體懸浮培養 將紅肉臍橙愈傷組織轉入液體MS培養基中懸浮培養，培養條件：26℃，100 rpm。每周傳代1次。

1.2.2超低溫處理 把懸浮培養的愈傷組織轉入冷凍管中，每管1克愈傷組織。把材料分為4組：未處理組，對照組，A組（PVS處理10分鐘），B組（PVS處理15分鐘）。將對照組、A組和B組在冰水混合物中處理10～15分鐘，然后放入液氮（LN）中，處理100分鐘。

1.2.3 細胞活性分析 將冷凍管從液氮中取出，迅速放到40℃水浴鍋中溫浴2分鐘，然后在操作臺中吸去PVS溶液，加入洗脫液洗滌40分鐘，中間換液3～4次。除去洗脫液，然后用TTC法檢測這些愈傷組織細胞活性。

TTC法檢測細胞活性：將液氮處理過的細胞轉入10毫升離心管中，加入等體積的磷酸緩沖液和TTC溶液各2毫升，置于37℃恒溫箱中，黑暗處理1小時，后加入硫酸（1 mol/L）終止反應，吸去TTC溶液和磷酸緩沖液，加入2毫升乙酸乙酯，然后轉入研缽中加入少量石英沙，充分研磨，提取被脫氫酶還原后生成的紅色的TTF，后把研缽中的乙酸乙酯轉入石英比色杯中，再加入3毫升乙酸乙酯，在分光光度計上測量在485nm處吸光度。用這種吸收值（TTC值）表示處理愈傷組織在超低溫保存后細胞的生活力。

2 結果與分析

細胞存活率的計算方法：

細胞存活率=（處理后細胞TTC值/未處理細胞TTC值）×100%

表1 ?TTC法檢測結果

注： “未處理”指未用超低溫和PVS處理，“對照”指用超低溫處理作為對照，“處理A”指PVS處理10分鐘后超低溫處理，“處理B”指PVS處理15分鐘后超低溫處理。

由表1可知，不用冷凍保護劑（PVS）處理，存活率為0.80%，用冷凍保護劑（PVS）處理10分鐘后，其存活率是1.67%。PVS處理15分鐘后，其存活率為4.54%。這說明超低溫處理后，細胞受到損傷，其存活率顯著降低，冷凍保護劑處理能提高其存活率。

3 討論

此研究還需要進一步優化PVS脫水溫度和脫水時間，降低對細胞的毒性，可以用其他復合冷凍保護劑，也可以優化超低溫冷凍程序，采用慢速冷凍法等。

參考文獻

[1] 危萬虎，李蘭，杜九山，魏靜，姜明蘭.紅肉臍橙生育特性與氣象條件[J].氣象科技.2005，33（01）：77-80.

[2] Uragami A， Sakar A， Nagai M. survival of culture cells and somatic embryo of Asparage officinadis L. cryoprerserved by vitrification[J]. Plant cell Reports， 1989（08）：418-421.

[3] Sakai A ， Kobayshi S， Oiyamal. Cryopresservation of nucellar cells of navel orange（Citrus sinensis ab. var. brasilientis Tanaka）by vitrification [J].Plant Cell Reports， 1990（09）：30-33.

[4] 李廣武，鄭從飛，唐兵.低溫生物學[M].長沙：湖南科學技術出版社，1998：67-72.

作者簡介：許勤勤，本科學歷，漯河市豫中南林業有害生物天敵繁育研究中心，助理工程師，研究方向：園林綠化及林業有害生物天敵方面的研究。