多功能芽孢桿菌AF1的生長條件與生理耐受特性研究

楊艷紅，李世川，胡 燕，劉余江

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

芽孢桿菌多數為腐生菌，具有產生抗性芽孢、繁殖能力強、耐熱、耐酸堿、理化性質穩定、抑菌譜廣泛等優點，存在很多潛在的特殊功能，特別是可產生多種胞外抗菌物質和包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等在內的多種酶類，因此在工農業生產以及科學研究中有廣泛的應用價值［1－3］。芽孢桿菌類微生物添加劑無毒、無害、無殘留，且具有促進畜禽生長、防治疾病等功效，是國際公認的可在飼料中直接使用的微生物菌種［4］。重慶理工大學生物工程實驗室分離到一株能產生高淀粉酶和蛋白酶活性、且具有廣譜抗菌活性的芽孢桿菌。本文就其生理耐受性特性和發酵條件進行研究，以期為該菌種應用于飼料微生物添加劑提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種AF1，由重慶理工大學生物工程實驗室分離。培養基為PDA培養基。

1.2 生長培養基的篩選

1.2.1 碳氮源篩選

在PDA培養基的基礎上，采用單因素實驗分別篩選AF1生長的最佳碳源和氮源分別為:4%蔗糖，2%蛋白胨、0.5%尿素。根據單因素實驗結果，進一步設計正交實驗，對蔗糖、蛋白胨和尿素濃度進行優化，以測定OD600代表菌體濃度。各因素水平設定值見表1。

表1 碳氮源正交設計因素水平

1.2.2 無機鹽篩選

微生物生長所需的無機鹽一般有磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。在細菌培養時通常添加以下無機鹽:MgSO4.7H2O、K2HPO4、NaCl、MnSO4、H2O、CaCl2、NaH2PO4。本實驗室選取以上6種無機鹽，在碳氮源篩選的基礎上，通過均勻設計實驗來進一步優化發酵培養基，以測定OD600代表菌體濃度。各因素設6個水平，其設定值見表2。

表2 無機鹽均勻設計因素水平

1.3 理化因素的篩選

先經單因素預實驗分別設定:溫度為10，25，35 ℃;pH 值為 2.0，5.0，7.0;搖床轉速為 150，250，280 r/min。對這3個水平進行初篩，結果顯示獲得較大OD600的條件分別是:pH值為7.0，溫度為35℃，轉速250 r/min。然后在確定的3個因素值附近分別設定3個水平進行正交實驗。正交實驗因素水平見表3。

表3 理化因素正交設計因素水平

1.4 生理耐受性實驗

1.4.1 pH 耐受性

以上述篩選的最優培養基為基礎，分別調節不同的pH值，每個pH值做3個平行實驗，在篩選的最佳條件下培養20 h后測定OD600值。

1.4.2 豬膽鹽耐受性

以上述篩選的最優培養基為基礎，分別添加豬膽鹽 0%，0.04%，0.08%，0.1%，0.2%，0.3%，每個濃度做3個平行實驗，在篩選的最佳條件下培養20 h后測定OD600值。

1.4.3 人工胃液耐受性

將AF1接種于以上篩選的最優培養基中進行活化，并參照文獻［5－6］把AF1菌接種于人工胃液，在最佳條件下進行搖床培養，分別于0，30，60和120 min取樣，采用活菌平板計數法測定活菌數量。

1.4.4 人工腸液耐受性

將AF1接種于以上篩選的最優培養基中進行活化，并參照文獻［5－6］把AF1菌接種于人工腸液，在最佳條件下進行搖床培養，分別于0，30，60和180 min取樣，采用活菌平板計數法測定活菌數量。

2 結果與討論

2.1 生長培養基篩選

2.1.1 碳氮源篩選

由表4中極差值R可以得出各因素對AF1菌生長的影響由大到小依次為:尿素＞蛋白胨＞蔗糖。同時，也可以知道AF1菌液體培養的最佳碳源和氮源組合為A3B1C1，即蛋白胨2.5%，尿素0.5%，蔗糖3.0%。為了驗證本次實驗中所確定的培養條件(碳源和氮源)是否可靠，選用原正交實驗中OD600值最大的實驗號(A3B1C3)與所篩選出的最佳條件作對比驗證實驗，結果如表5所示。可見原實驗中OD值最大的實驗組合的OD值小于我們所篩選出最佳條件的OD值。因此，A3B1C1仍然是最佳的組合，同上述分析結果吻合。因此，最后確定AF1生長培養基中最佳碳源和氮源的組合為:3.0%蔗糖，0.5%尿素，2.5%蛋白胨。

表4 碳源和氮源正交實驗結果

表5 驗證實驗結果

2.1.2 無機鹽篩選

對表6實驗結果用SPSS軟件進行回歸分析，可得出回歸方程為:y=6.62 －13.54x1+0.66x3。這是一個二元線性回歸方程，為檢驗其可信性，對回歸方程進行方差分析，其方差分析表［7］如表7所示。由方差分析結果可知該線性方程是比較可靠的，回歸方程中x1的系數為負，x3的系數為正，表明菌體OD600值隨因素x1(MgSO4·7H2O)的增加而下降，隨著因素x3(NaCl)的增加而上升。因此，在確定無機鹽的最優方案時，將MgSO4·7H2O的量取下限，即為0%，NaCl的量取上限，即為1.0%。為了驗證篩選結果的準確性，選取原實驗設計中OD600值最大的實驗條件(即表6中2號實驗)和篩選出的實驗條件作對比驗證。結果顯示，原設計中2號實驗的OD600值為7.64，小于所篩選出最佳條件的OD600值9.96，可見實驗結果可靠。無機鹽是微生物生長必不可少的一類營養物質，在細菌機體中的生理功能主要是作為酶活性中心的組成部分、維持生物大分子和細胞結構的穩定性、調節并維持細胞的滲透壓平衡、控制細胞的氧化還原電位和作為某些微生物生長的能源物質等。微生物生長所需的無機鹽一般有磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。在微生物的生長過程中還需要一些微量元素。微量元素是指那些在微生物生長過程中起重要作用，而微生物機體對這些元素的需要量極其微小的元素，通常需要量在 10－6～10－8mol/L(培養基中含量)。微量元素一般參與酶的組成或使酶活化［8］。由上述結果可見，本實驗中，K2HPO4、MnSO4.H2O、CaCl2、NaH2PO4對AF1菌的生長幾乎無影響，而MgSO4·7H2O對其生長有負影響，NaCl有正影響。最終只選定NaCl這一無機鹽補充到培養基中。這可能是由于本實驗中的培養基中添加了天然土豆汁，其中含有豐富的微量元素可完全滿足AF1菌生長。綜合碳氮源篩選結果，AF1菌的生長培養基優化為:馬鈴薯20 g，蔗糖 3 g，蛋白胨 2.5 g，尿素 0.5 g，NaCl 1.0 g，蒸餾水100 mL。本培養基中由于馬鈴薯的質量不好控制，因此本實驗室參照土豆的主要有效成分，以這些成分為篩選對象，對培養基進行進一步優化。

表6 無機鹽均勻實驗結果

表7 方差分析表

2.2 理化因素篩選

由極差值R可以得出各因素對AF1菌生長的影響由大到小依次為:溫度＞轉速＞初始pH值。同時，也可以知道AF1液體培養的最佳理化條件組合為A3B3C2，即溫度為37℃，初始pH值為7.0，搖床轉速為200 r/min。

2.3 生理耐受性實驗

2.3.1 pH 耐受性

動物胃中的pH值范圍常在2～7，一般為3.0。胃環境對細菌的破壞是pH依賴性的酸水解作用，當pH值為2.5時，殺菌作用很明顯。因此，益生菌必須有良好的耐酸能力，才能通過高酸性的胃環境而到達腸道發揮作用［9］。由圖1可知，AF1在pH值為2～9時均可以生長，而在pH值為4～8時生長較好，其最佳生長pH值為7。因此，該菌有很好的耐酸性，可以耐受動物胃的低pH環境，并順利進入pH值約為7.6的小腸發揮作用。

表8 理化因素正交實驗結果

圖1 AF1的pH耐受性

2.3.2 膽鹽耐受性

益生菌進入腸道后，小腸中膽鹽的高滲透壓環境不利于其存活。動物腸道中膽鹽的含量為0.03% ～0.3%(W/V)，并不斷發生變化，一般認為其平均含量為0.03%［10］。如圖2所示，AF1菌株在膽鹽濃度為0.04% ～0.3%均有一定耐受能力。隨著膽鹽濃度的升高，AF1的存活數呈現緩慢的下降趨勢。因此，AF1菌株能耐受腸道的膽鹽環境。

2.3.3 人工胃液耐受性

動物的胃在pH值為3.0左右的酸性環境下激活胃液中的胃蛋白酶原，從而殺死胃內的細菌，食物通過胃的時間相對較短，一般為1～2 h［11］。由表9可知，AF1在加了胃蛋白酶的人工胃液中2 h后還能存活，因此，AF1對胃液有耐受能力。

表9 在不同培養時間下AF1在模擬胃液中的存活率

2.3.4 人工腸液耐受性

小腸內消化是整個消化過程中重要的階段，也是各種益生菌制劑發揮作用的場所。小腸液的pH值約為7.6，其中除了大量的水分外，還有各種酶、膽汁鹽等多種成分，對腸內菌群有著多方面的影響。食物通過動物小腸的平均時間約為1.5 h。益生菌只有經受住小腸液作用，保持一定數量的存活率才能發揮作用［5，11］。由表10可知，人工腸液對AF1菌株幾乎沒有影響，這說明AF1菌株能夠耐受腸液環境，可以在腸液中生長。

表10 在不同培養時間下AF1在模擬人工腸液中的存活率

3 結束語

本文研究的芽孢桿菌AF1不僅可以產生高活性淀粉酶和蛋白酶，還具有廣譜抗菌活性，若用于動物，不僅可以提高飼料利用率，促進生長，同時可以預防動物疾病發生。通過對AF1研究，發現其具有腸道環境耐受性好的優點，可為新型飼料微生態制劑的開發提供菌種來源。

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