孔雀嗉囊毛細線蟲的分子鑒定

王榮瓊　劉永張　鄒豐才　楊建發　彭潔.云南農業職業技術學院，昆明650；.云南省昆明動物園，昆明6500；.云南農業大學動物科學技術學院，昆明6500

孔雀嗉囊毛細線蟲的分子鑒定

王榮瓊1劉永張2鄒豐才3*楊建發3彭潔1
1.云南農業職業技術學院，昆明650212；2.云南省昆明動物園，昆明650021；3.云南農業大學動物科學技術學院，昆明650201

通過分子生物學方法對來自昆明市圓通山動物園孔雀消化道中收集的線蟲進行鑒定。結果顯示，該線蟲與GenBank發表的澳大利亞袋鼠毛細線蟲COX1序列的相似性為77.3%，證明該線蟲為毛細科毛細屬的毛細線蟲。COX1序列分析表明序列差異較明顯，說明孔雀毛細線蟲不同于澳大利亞袋鼠毛細線蟲，它們存在著遺傳背景的差異。

孔雀；毛細線蟲；COX1序列；分子鑒定

毛細線蟲病是由毛細科（Capillariidae）毛細屬（Capillaria）的多種線蟲寄生于禽類食道、嗉囊、腸道等消化道內的一種寄生蟲病。輕度感染時，局部出現輕微炎癥和增厚；嚴重感染時，炎癥加劇，并出現黏液或濃性分泌物，剖檢可見寄生部位消化道出血，黏膜上有大量蟲體，嚴重感染時，可引起死亡。病初如誤用消炎藥或抗球蟲藥，會延誤病情的治療，因此對其鑒定到種顯得由為重要[1]。

本項試驗擬進一步深入研究形態學所不能解決的問題，欲通過分子生物學技術鑒定孔雀嗉囊內的毛細屬線蟲，以期能確定到種。這是首次在云南采用分子生物學的方法對孔雀寄生蟲的種屬關系進行鑒定。對保護世界瀕危物種及鑒定寄生蟲的種類來豐富蟲種資源有重要的意義。也為今后孔雀體內線蟲的分類、鑒別診斷、分子流行病學調查以及本病的防治等更深入的研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

蟲體樣品：由昆明市圓通山動物園提供。

主要試劑：購買于北京百泰克生物技術有限公司。

1.2方法

1）蟲體的分離及處理。將園內發病死亡的1只成年孔雀，用寄生蟲學完全解剖法獲取寄生于孔雀嗉囊內的線蟲，將洗凈的蟲體轉移到新的離心管中用75%乙醇保存備用。

用鑷子將保存在75%乙醇溶液中的蟲體材料取出，用雙蒸水反復吹打沖洗2～3次后，置于一新的1.5 mL的離心管中。

2）蟲體DNA的提取。蟲體DNA提取按細胞/組織基因組DNA提取試劑盒使用說明進行。

3）蟲體DNA的PCR擴增。擴增體系中各試劑的量分別是ddH2O 10.75μL，10×PCR buffer 3.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）4.0μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）3.0μL，Forward primer（50 pmol/μL）0.5μL，Reverse primer（50 pmol/μL）0.5μL，rTap（5 U/μL）0.25μL，模板（gDNA）3.0μL，共計25μL。混勻然后于PCR擴增儀中按已設好PCR擴增條件進行擴增。

PCR擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環，最后72℃延伸5 min。

擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射儀上觀察結果，并拍照記錄。

4）引物的設計。依據Bowles文獻[10]設計1對引物，擴增了從孔雀嗉囊內分離的線蟲線粒體DNA（mtDNA）細胞色素C氧化酶第1亞基（COX1），由上海生物工程技術有限公司產品合成。

JB3（5′-TTTTTTGGGGATCCTGAGGTTTAT-3′）

JB4.5（5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′）

2　結果與分析

2.1測序結果

電泳后，通過線性DNA條帶的相對位置可初步估計樣品的分子量大約為450 bp左右，如圖1所示。

圖1　擴增的線蟲c o x 1 RCR產物

序列堿基數共計417個bp：

CCAATCATGATCTCGCATTTGGTGCAGTTTCT GAGCTTTGATAAATATTTCAGGAAAGTTTAAAGTA TTTGGCCCATTAGGAATAATCTATGCTATAATAAG AATCGGCTTATTAGGCTGTTTTGTTTGAGGTCATCA TATATATACTGTAGGAATAGACGTGGACACACGA GCATATTTTACTGCTGCTACTATGATCATTGGAGTC CCTACTGGAGTAAAAGTATTTAGCTGAATGGCTAC TATATACGGAACTTCCACTAAATCTTCACCTCTTTT ACTATGAACTTTAGGATTTATTTCATTATTTACAAT TGGAGGTCTAACCGGAATTTCTCTCTCTAATGCTT CTTTAGATCTTCTACTTCATGATACATACTACGTAG TAGGTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTTAAA

測序結果與預期的一致，將上述測序結果上傳到網上進行Blast分析，結果顯示該線蟲與澳大利亞袋鼠體內的毛細線蟲有77.3%的同源性，因此確認該線蟲為毛細線蟲。

2.2 COX1序列的分析與比較

測序后去掉引物，找到COX1序列的頭尾，結果發現孔雀毛細線蟲樣品的COX1序列的長度為417 bp，而澳大利亞袋鼠毛細線蟲COX1序列（GenBank注冊號AJ288162.1）的長度為374 bp。

圖2　樣品與網上澳大利亞袋鼠的毛細線蟲COX1的相似百分比

圖3　COX 1對比的進化樹

將該線蟲的COX1序列與網上公布的澳大利亞袋鼠毛細線蟲COX1序列用DNA Star軟件進行比較相似百分比分析（圖2～3）可知，其COX1相似性為77.3%，序列差異較明顯（圖4）。發現孔雀毛細線蟲單獨形成一個分支，說明孔雀毛細線蟲不同于袋鼠毛細線蟲，他們存在著地域及遺傳背景的差異。也說明了孔雀毛細線蟲COX1序列存在種的特異性，可作為鑒別孔雀毛細線蟲與相似種的有效遺傳標記。

圖4　孔雀毛細線蟲與澳大利亞袋鼠毛細線蟲CO X 1序列比較

3　結論

野生動物寄生蟲研究較少，很多寄生蟲嚴重威脅著我國珍貴野生動物。將該線蟲的COX1序列與GenBank公布的澳大利亞袋鼠的毛細線蟲的COX1比較分析，相似性為77.3%。說明孔雀毛細線蟲與袋鼠毛細線蟲具有遺傳背景差異，也說明孔雀毛細線蟲COX1序列存在種的特異性，可作為鑒別孔雀毛細線蟲與相似種的有效遺傳標記。但對野生動物寄生蟲的研究遠遠還不夠，需要投入更多的人力和物力來填補這方面的空白[2-6，8]。

近年來線粒體DNA已被廣泛用作多態性研究的重要遺傳標記，結合PCR擴增及其他方法已成功地應用于多種寄生蟲的分子鑒定和分類，通過其序列的變化可反映生物種群內和群體間的遺傳變異，且mtDNA特別適用于相似種和亞種的鑒定[7-8]。

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2015-07-04

云南省教育廳科學研究基金項目（2010C130）

王榮瓊，女，1978年生，在職獸醫碩士，副教授。