費(fèi)氏弧菌綜合毒性法對(duì)不同種類(lèi)污染物的應(yīng)急監(jiān)測(cè)試驗(yàn)研究

李 汝，逯南南，李 梅，宋武昌，孫韶華，賈瑞寶

(1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250021)

費(fèi)氏弧菌綜合毒性法對(duì)不同種類(lèi)污染物的應(yīng)急監(jiān)測(cè)試驗(yàn)研究

李 汝1,2，逯南南2，李 梅1，宋武昌2，孫韶華2，賈瑞寶2

(1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250021)

以突發(fā)水環(huán)境污染事件中常見(jiàn)的重金屬、農(nóng)藥和工業(yè)有機(jī)物三大類(lèi)污染物為研究對(duì)象，利用海洋發(fā)光菌費(fèi)氏弧菌進(jìn)行發(fā)光菌綜合毒性法試驗(yàn)研究。結(jié)果表明：采用凍干菌粉快速?gòu)?fù)蘇技術(shù)對(duì)重金屬、農(nóng)藥和工業(yè)有機(jī)污染物進(jìn)行應(yīng)急監(jiān)測(cè)時(shí)，與發(fā)光菌的接觸時(shí)間可用10 min代替?zhèn)鹘y(tǒng)的推薦接觸時(shí)間15 min；重金屬、農(nóng)藥以及工業(yè)有機(jī)污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率隨特定污染物濃度增加而增大，不同特定污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌的影響程度不同，可實(shí)現(xiàn)發(fā)光菌綜合毒性法進(jìn)行水質(zhì)應(yīng)急監(jiān)測(cè)。

費(fèi)氏弧菌；綜合毒性法；發(fā)光抑制率；水質(zhì)應(yīng)急監(jiān)測(cè)技術(shù)；重金屬；農(nóng)藥；工業(yè)有機(jī)污染物

在環(huán)境污染突發(fā)事件中，污染源以及污染物一般具有不確定性[1]，水質(zhì)應(yīng)急監(jiān)測(cè)以及水質(zhì)預(yù)警需要比普通理化分析方法更快速、更靈敏的監(jiān)測(cè)手段[2-4]。發(fā)光細(xì)菌(也稱(chēng)發(fā)光菌)綜合毒性法[5]就是基于發(fā)光菌光效應(yīng)在450～490 nm波長(zhǎng)下發(fā)射可見(jiàn)熒光的生理特性進(jìn)行的一種靈敏度高、相關(guān)性好、反應(yīng)速度快、自動(dòng)化程度高的生物毒性監(jiān)測(cè)方法[6-7]。

自1672年Boyle開(kāi)始研究發(fā)光菌的發(fā)光受化學(xué)物質(zhì)抑制以來(lái)，1976年Hastings、Wilson以提出了有機(jī)物對(duì)發(fā)光菌發(fā)光抑制效應(yīng)及毒性作用機(jī)制[8]，促進(jìn)了生物毒性監(jiān)測(cè)的發(fā)展，隨后美國(guó)Beckman儀器公司研制了生物毒性測(cè)試系統(tǒng)(Microtox)以及便攜式毒性測(cè)定儀(Deltatox)，荷蘭microLAN B.V.公司研制了基于費(fèi)氏弧菌的在線毒性測(cè)定儀(TOXcontrol)以及便攜式毒性測(cè)定儀(Check Light)等[9-10]。1995年，我國(guó)頒布了應(yīng)用發(fā)光菌進(jìn)行水質(zhì)毒性測(cè)試的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，大量學(xué)者也利用發(fā)光菌的不同種類(lèi)進(jìn)行了重金屬、有機(jī)溶劑、除草劑等的毒性評(píng)價(jià)，并研究了最佳測(cè)試條件、毒性與污染物的相關(guān)性等[11-15]。基于上述研究，本文以突發(fā)水環(huán)境污染事件中常見(jiàn)的重金屬、農(nóng)藥和工業(yè)有機(jī)污染物三大類(lèi)污染物為研究對(duì)象，選取海洋發(fā)光菌(費(fèi)氏弧菌)對(duì)二價(jià)鋅(Zn2+)、六價(jià)鉻(Cr6+)、二價(jià)銅(Cu2+)、馬拉硫磷、百菌清、苯酚和四氯化碳等不同種類(lèi)污染物進(jìn)行費(fèi)氏弧菌的生物綜合毒性檢測(cè)，從而得出費(fèi)氏弧菌對(duì)不同種類(lèi)污染物的敏感性差異、不同作用時(shí)間的發(fā)光抑制率以及適用于水質(zhì)應(yīng)急檢測(cè)的作用時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

受試菌種：中科院南京土壤微生物所提供費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)凍干粉。

菌種復(fù)蘇稀釋液：與費(fèi)氏弧菌凍干粉配套。

培養(yǎng)裝置：TOX bioshaker細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)生器(荷蘭MicroLAN B.V.公司)。

檢測(cè)設(shè)備：Check Light-TOX-Screen3水質(zhì)毒性檢測(cè)儀(荷蘭MicroLAN B.V.公司)。

特定污染物：ZnSO4、K2Cr2O7、CuSO4、馬拉硫磷、百菌清、苯酚、四氯化碳，均為優(yōu)級(jí)純。

毒性物質(zhì)濃度設(shè)定：配置母液Zn2+為100 mg/L、Cr6+為100 mg/L、Cu2+為50 mg/L、馬拉硫磷為10 mg/L、百菌清為50 mg/L、苯酚為50 mg/L、四氯化碳為10 mg/L。各污染物的濃度系列設(shè)定見(jiàn)表1。

表1 污染物濃度系列設(shè)定(mg/L)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 費(fèi)氏弧菌的復(fù)蘇

將儲(chǔ)存在-20℃下的費(fèi)氏弧菌凍干粉與菌種復(fù)蘇稀釋液混合，放置于TOX bioshaker細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)生器上振蕩培養(yǎng)15 h[15-16]，目的是獲得發(fā)光度高、相對(duì)穩(wěn)定且靈敏度高的費(fèi)氏弧菌懸液；然后吸取0.1 mL費(fèi)氏弧菌懸液測(cè)定其原始發(fā)光量(I0)，需要發(fā)光強(qiáng)度大于500 000[17-18]。

1.2.2 費(fèi)氏弧菌懸液樣品的預(yù)處理

采用不同污染物配制母液，試驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行不同梯度的稀釋?zhuān)⒄{(diào)節(jié)測(cè)試樣品的滲透壓，即NaCl濃度為2%。

1.2.3 綜合毒性測(cè)試方法

試驗(yàn)采用菌種復(fù)蘇稀釋液作為試驗(yàn)空白與不同測(cè)試樣品用槍頭混合均勻后，在0 min、5 min、10 min、15 min時(shí)測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度，并記錄其讀數(shù)。由于測(cè)試時(shí)間內(nèi)對(duì)照樣品發(fā)光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生改變，因此需按照下面公式計(jì)算測(cè)試樣品的發(fā)光抑制率[18-20]:

(1)

ICt=IS0·fk(t=5min、10min、15min)

(2)

(t=5min、10min、15min)

(3)

式中：fk為修正系數(shù)；IR5、IR10、IR15分別為5min、10min、15min后對(duì)照樣品的發(fā)光強(qiáng)度(cd);IR0、IS0分別為對(duì)照樣品和測(cè)試樣品的初始發(fā)光強(qiáng)度(cd)；ISt、ICt分別為不同時(shí)刻測(cè)試樣品的發(fā)光強(qiáng)度和修正發(fā)光強(qiáng)度(cd)。

利用試驗(yàn)所得的費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率與污染物濃度作發(fā)光抑制作用曲線，獲得曲線擬合方程，并可求得發(fā)光菌的半致死率EC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類(lèi)污染物與費(fèi)氏弧菌不同接觸時(shí)間的毒性比較

有毒污染物進(jìn)入發(fā)光菌生存環(huán)境后，通過(guò)直接抑制細(xì)菌發(fā)光反應(yīng)過(guò)程的酶活性，或是抑制細(xì)菌體內(nèi)發(fā)光反應(yīng)相關(guān)的代謝反應(yīng)進(jìn)而抑制菌體發(fā)光強(qiáng)度。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同濃度污染物與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間在5min、10min、15min下的發(fā)光抑制率，來(lái)確定不同種類(lèi)污染物與費(fèi)氏弧菌接觸反應(yīng)的合適時(shí)間。

2.1.1 重金屬類(lèi)污染物

圖1至圖3為重金屬類(lèi)不同濃度污染物Zn2+、Cr6+、Cu2+與費(fèi)氏菌接觸時(shí)間為5min、10min、15min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線。由圖1至圖3可見(jiàn)：重金屬類(lèi)污染物Zn2+、Cu2+與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為10min、15min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線接近，且略高于接觸時(shí)間5min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線；重金屬類(lèi)污染物Cr6+與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為5min、10min、15min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線具有平行性，且接觸時(shí)間越長(zhǎng)發(fā)光抑制率越大。

2.1.2 農(nóng)藥類(lèi)污染物

圖4和圖5為農(nóng)藥類(lèi)不同濃度污染物馬拉硫磷、百菌清與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為5min、10min、15min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線。由圖4和圖5可見(jiàn)：農(nóng)藥類(lèi)污染物馬拉硫磷、百菌清與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為10min、15min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線接近，且具有平行性；農(nóng)藥類(lèi)污染物低濃度下5min測(cè)定費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率較10min、15min的發(fā)光抑制率偏高，農(nóng)藥類(lèi)污染物高濃度下5min測(cè)定費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率較10min、15min的發(fā)光抑制率略低。

2.1.3 工業(yè)有機(jī)污染物

圖6和圖7為工業(yè)有機(jī)污染物苯酚、四氯化碳與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為5min、10min、15min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線。由圖6和圖7可見(jiàn):工業(yè)有機(jī)污染物苯酚、四氯化碳與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為5min、10min、15min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線在較高濃度下接近，具有一致性；在低濃度下10min、15min時(shí)的發(fā)光抑制率接近，且略高于5min。

2.2 不同種類(lèi)污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌的急性毒性作用

有毒有害污染物進(jìn)入水體，費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度受到抑制，其發(fā)光抑制率與污染物濃度具有一定比例關(guān)系。本試驗(yàn)基于不同種類(lèi)污染物與費(fèi)氏弧菌不同接觸時(shí)間的毒性效應(yīng)進(jìn)行比較，此階段試驗(yàn)采用污染物與費(fèi)氏弧菌的接觸反應(yīng)時(shí)間為10min進(jìn)行。

2.2.1 重金屬類(lèi)污染物

重金屬類(lèi)污染物Zn2+、Cu2+、Cr6+對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性效應(yīng)見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn)，Zn2+濃度為3mg/L

時(shí)對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率達(dá)到49.5%，Zn2+濃度為5mg/L時(shí)高達(dá)91.5%；Cu2+濃度低于1mg/L時(shí)對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率在28.2%以下，Cu2+濃度為5mg/L時(shí)高達(dá)62.18%；Cr6+濃度為70mg/L時(shí)對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率也低于50%。上述試驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明，重金屬類(lèi)污染物在較低濃度下，對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性效應(yīng)增長(zhǎng)較快，隨著污染物濃度的增加，其對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性效應(yīng)增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，且毒性效應(yīng)增長(zhǎng)速度表現(xiàn)為：Zn2+>Cu2+>Cr6+。

2.2.2 農(nóng)藥類(lèi)污染物

農(nóng)藥類(lèi)污染物作用于費(fèi)氏弧菌，可抑制菌體發(fā)光效應(yīng)。農(nóng)藥類(lèi)污染物馬拉硫磷、百菌清對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性效應(yīng)見(jiàn)圖9。由圖9可見(jiàn)，馬拉硫磷、百菌清對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率隨污染物濃度的增加而逐漸增大。與其他類(lèi)污染物相比，農(nóng)藥類(lèi)污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性效應(yīng)隨污染物濃度增加而增大的程度更快，這是因?yàn)轳R拉硫磷、百菌清分別屬于有機(jī)磷類(lèi)、取代苯類(lèi)農(nóng)藥，費(fèi)氏弧菌對(duì)有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥更為敏感。

2.2.3 工業(yè)有機(jī)污染物

工業(yè)有機(jī)污染物苯酚、四氯化碳對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性效應(yīng)見(jiàn)圖10。由圖10可見(jiàn)，工業(yè)有機(jī)污染物苯酚、四氯化碳在不同濃度下，可造成費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率的變化，污染物濃度與費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度具有一定的負(fù)相關(guān)性；苯酚對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性效應(yīng)小于四氯化碳。

2.3 不同種類(lèi)污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性評(píng)價(jià)

不同種類(lèi)污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光效應(yīng)的正常代謝會(huì)造成影響，表現(xiàn)為污染物濃度越大，發(fā)光抑制程度越大，即費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率與污染物濃度呈正相關(guān)。發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度抑制率反映污染物對(duì)發(fā)光菌的毒性大小，而發(fā)光菌的半致死率(EC50)反映發(fā)光菌對(duì)污染物的敏感程度大小，故發(fā)光菌的EC50越小，說(shuō)明發(fā)光菌對(duì)污染物越敏感，污染物對(duì)發(fā)光菌的毒性越大。表2為不同污染物與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為10min和15min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線的擬合方程和EC50。由于Cr6+濃度在70mg/L時(shí)對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率已低于50%，故K2Cr2O7對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制作用曲線方程擬合不能較準(zhǔn)確地反映六價(jià)鉻濃度對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率的趨勢(shì)，且EC50>70mg/L，可見(jiàn)費(fèi)氏弧菌對(duì)Cr6+的敏感性低于Zn2+、Cu2+。鋅元素本身是生物體發(fā)育成長(zhǎng)所需的微量元素，其對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制作用曲線的擬合方程與其他污染物不具有一致性。通過(guò)對(duì)相同接觸時(shí)間不同種類(lèi)污染物的EC50進(jìn)行比較，可得出費(fèi)氏弧菌對(duì)不同種類(lèi)污染物的敏感性順序如下：重金屬類(lèi)污染物為Zn2+>Cu2+>Cr6+；農(nóng)藥類(lèi)污染物為馬拉硫磷>百菌清；工業(yè)有機(jī)污染物為四氯化碳>苯酚。即不同種類(lèi)污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌毒性作用排序如下：重金屬類(lèi)污染物為Zn2+>Cu2+>Cr6+；農(nóng)藥類(lèi)污染物為馬拉硫磷>百菌清；工業(yè)有機(jī)污染物為四氯化碳>苯酚。此外，通過(guò)對(duì)同一污染物與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為10min和15min的EC50進(jìn)行比較，可得出除營(yíng)養(yǎng)元素鋅外，污染物與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為10min時(shí)的EC50均大于或略大于15min時(shí)的EC50。

表2 不同污染物與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為10 min和15 min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線的擬合方程和半致死率(EC50)

3 結(jié) 論

(1) 比較污染物與費(fèi)氏弧菌不同接觸時(shí)間的發(fā)光抑制作用曲線，可見(jiàn)不同種類(lèi)污染物10 min與15 min發(fā)光抑制作用曲線接近，具有一定的平行性，在應(yīng)急監(jiān)測(cè)中為提高應(yīng)急效率，可以選擇污染物與費(fèi)氏弧菌的接觸時(shí)間為10 min。

(2) 比較三類(lèi)污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性作用曲線，可見(jiàn)污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率隨污染物濃度增加而增大，重金屬類(lèi)污染物對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光抑制作用曲線與農(nóng)藥類(lèi)污染物、工業(yè)有機(jī)污染物相比其斜率較大，即說(shuō)明費(fèi)氏弧菌對(duì)重金屬類(lèi)污染物較敏感。

(3) 根據(jù)各污染物對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光抑制作用曲線擬合方程所得的半致死率(EC50)，可得出費(fèi)氏弧菌對(duì)不同污染物的敏感程度排序和污染物對(duì)費(fèi)氏弧菌的急性毒性作用排序：重金屬類(lèi)污染物為Zn2+>Cu2+>Cr6+；農(nóng)藥類(lèi)污染物為馬拉硫磷>百菌清；工業(yè)有機(jī)污染物為四氯化碳>苯酚。除營(yíng)養(yǎng)元素鋅外，污染物與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為10 min時(shí)的EC50大于或略大于15 min時(shí)的EC50。

(4) 費(fèi)氏弧菌應(yīng)急監(jiān)測(cè)是一種快速篩選生物毒性的綜合毒性法，其反應(yīng)速度快、準(zhǔn)確度較高，適合作為水質(zhì)常規(guī)監(jiān)測(cè)技術(shù)的補(bǔ)充手段，并在快速檢測(cè)中有著廣泛應(yīng)用前景，對(duì)保障水質(zhì)安全具有指導(dǎo)意義。

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[19]劉萍,鮑雷,余家燕,等.水質(zhì)生物毒性儀在水質(zhì)自動(dòng)監(jiān)測(cè)站的應(yīng)用[J].分析儀器,2014(2):60-64.

[20]馬勇,黃燕,賈玉玲,等.發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試方法的優(yōu)化研究[J].環(huán)境污染與防治,2010,32(11):48-52.

Experiment Study of the Emergency Monitoring on Different Types of Pollutants byVibrioFischeriComprehensive Toxicity Method

LI Ru1,2,LU Nannan2,LI Mei1,SONG Wuchang2,SUN Shaohua2,JIA Ruibao2

(1.CollegeofEnvironmentalandMunicipalEngineering,ShandongJianzhuUniversity,Jinan250101,China；2.ShandongProvinceCityWaterSupplyandDrainageWater
QualityMonitoringCenter,Jinan250021,China)

This paper takes three common types of pollutants,namely heavy metals in water,pesticides and organic matter,as the research object,and applies the marine luminousVibrioFischerito the experiment study of the comprehensive toxicity of luminous bacteria.The result shows that by using freeze-dried powder rapid recovery technology for emergency monitoring,the contact time between bacteria and heavy metals,pesticides,poisonous and industrial organic pollutants is 10 min instead of the standard 15 min.Specific pollutants including heavy metals,agriculture chemicals and poisonous and harmful organics influence the bacteria light,and the light-limit rate increases with the concentration of pollutants.The influence of different pollutants is at different levels,which can realize the emergency monitoring of water quality by luminous bacteria comprehensive toxicity method.Key words:Vibriofischeri;comprehensive toxicity;light-limit rate;emergency monitoring technology for water quality;heavy metal;pesticide chemical;poisonous organic pollutant

1671-1556(2015)04-0104-06

2014-12-03

2015-05-08

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014CP019)；國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX07404-003)；國(guó)家科技部項(xiàng)目(直飲水科技惠民示范工程)(2013GS370202)

李 汝(1989—)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)轱嬘盟踩-mail：liru01@yeah.net

X832

A

10.13578/j.cnki.issn.1671-1556.2015.04.018

賈瑞寶(1968—)，男，研究員，主要從事城市供水污染控制、供水應(yīng)急處理等方面的研究。E-mail：jiaruibao68@126.com