PFOA和PFOS對大型蚤急性毒性試驗研究

劉 冉,曹志會,趙 月,王 冰,沈洪艷,楊杰頻

(1.河北省環境工程評估中心，河北 石家莊050051；2.河北科技大學環境科學與工程學院，河北 石家莊 050080；3.河北省藥用分子化學實驗室，河北 石家莊 050080)

PFOA和PFOS對大型蚤急性毒性試驗研究

劉 冉1,曹志會2,3,趙 月2,3,王 冰2,3,沈洪艷2,3,楊杰頻2,3

(1.河北省環境工程評估中心，河北 石家莊050051；2.河北科技大學環境科學與工程學院，河北 石家莊 050080；3.河北省藥用分子化學實驗室，河北 石家莊 050080)

試驗采用靜態暴露法研究了全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)對大型蚤的急性毒性效應。試驗結果表明：PFOA和PFOS對大型蚤均具有急性毒性效應。當大型蚤暴露于PFOA和PFOS 72 h時LC50值分別為102.41 mg/L(95%置信區間為9.32～115.23 mg/L)、70.65 mg/L(95%置信區間為65.32～77.21 mg/L)，說明大型蚤對PFOS的毒性效應更為敏感，且72 h內PFOA和PFOS對大型蚤的LC50值均隨暴露濃度的增加及暴露時間的延長而降低；按照魚類生態毒性分級，PFOA和PFOS對大型蚤的毒性等級均為低毒物質，而按照美國華盛頓州化學品毒性分級，均屬于D級，即最低級毒性物質；暴露于PFOA和PFOS大型蚤的觀察終點EC50值表明，PFOA和PFOS對大型蚤的活動抑制程度均隨暴露時間的增加而增強，這與本研究得出的LC50值結果一致，且PFOS比PFOA對大型蚤表現出更強的抑制作用。可見，無論在大型蚤致死效應試驗中還是活動抑制試驗中，PFOS的毒性均強于PFOA。

全氟辛酸；全氟辛烷磺酸；大型蚤；急性毒性試驗；寇式法

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)、全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate,PFOS)作為典型的全氟化合物(PFCs)[1]，被定義為耐久性的有機污染物，因其被大范圍使用從而導致了全球范圍內的廣泛分布和殘留。由于它們擁有很強的化學穩定性及生物惰性，能夠經受較強光、熱、化學和微生物作用以及動物的代謝，因而很難被降解[2]，是一類最難降解的耐久性有機污染物。

近年來，PFOA和PFOS在環境水體、野生生物[3]和人體組織中都有一定量的檢出[4]。其在生物體內主要分布于血液和肝臟，并能引起器官病變、生殖干擾、免疫毒性和致癌性等[5]。此外，PFOA和PFOS還具有很強的生物累積性，哺乳動物、蚤類和其他水生生物食物鏈等高生態位的水生生物對PFCs具有很強的生物富集作用[6]。

大型蚤(Daphniamagna)是一類小型的枝角類動物，為蚤科蚤屬的水生生物，屬于浮游甲殼類，廣泛分布于亞洲、歐洲、北美洲以及非洲。大型蚤主要生存于大自然水域，這類生物的生命周期短、繁衍后代快[7-11]，這使其在實驗室培養比較方便。大量實驗證明大型蚤對毒物很敏感，因此研究水環境中殘留污染物對大型蚤的毒性效應可對其毒性可能引起的食物鏈高端生物的潛在危害起到預報作用。為此，本文選用大型蚤作為受試生物，研究PFOA和PFOS對大型蚤的毒理學效應，以更好地解釋與評價PFCs在生態環境中的污染效應與行為。

1 材料與方法

1.1 試驗生物

本試驗受試生物大型蚤取自南開大學。用1～2 L的玻璃缸，加入500～1 000 mL曝氣水(曝氣3 d以上的實驗室用水或自來水)，放入10～20個大型水蚤，在實驗室自然光照下進行養殖。試驗溫度為15～25℃，溶解氧濃度高于2 mg/L，pH值為7.5±0.5，硬度以CaCO3計為250±25 mg/L。大型蚤的生命周期平均為49.5 d，其生第一胎時間一般在第7.3 d。在眾多用于運動的觸角中，大型蚤主要運用第二對觸角，即大觸角進行形式多樣的運動，其中典型的運動形式有枝角擺動和翻轉運動，由于其器官俱全且身體透明，解剖鏡下可直接觀察到中毒癥狀及心臟的跳動情況。

用實驗室培養的斜生柵藻擴大培養液喂養大型蚤，每周全換培養液1～2次，每天追加1次。培養液中的柵藻濃度不應太高，以防晚間培養液缺氧而導致大型蚤的死亡，通常在106個/L即可，觀察藻液的顏色為淡綠色最佳。實驗室培養柵藻的培養液用以下幾種無機鹽配制：硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.1 g，硫酸銨[(NH4)2SO4] 0.2 g，碳酸氫鈉(NaHCO3)0.1 g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.02 g，氯化鈣(CaCl2·2H2O)0.03 g，雙蒸水1 000 mL。柵藻種存放在玻璃缸中，控制水溫為15～25 ℃且在日光照射下進行培養，每天攪拌5～6次。用以上方法培養的柵藻藻種擴大培養，藻液與雙蒸水按1∶2配備，每隔3 d追加1次脲素，但注意脲素的濃度始終不可超過10 mg/L，并用此柵藻藻液直接喂養大型蚤。

1.2 試驗藥品與設備

試驗藥品：PFOA(CAS:307-34-6);PFOS(CAS：1763-23-1);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO);雙蒸水。

試驗設備：倒置顯微鏡;數碼像機;100 mL燒杯;BBC-226STV型Haier家用電冰箱(青島海爾股份有限公司)；JPBJ-608型溶解氧測定儀(上海精密科學與儀器有限公司)；FE20型pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；溫度計和水硬度計等。

1.3 試驗方法

通過對國內外大型水蚤生物測試的方法進行比較，本試驗采用靜態暴露法，按照《水質 物質對蚤類(大型蚤)急性毒性測定方法》(GB/T 13266—91)[10]對大型蚤生物毒性進行測試，研究兩種PFCs對大型蚤的急性毒性效應，用寇氏法獲得大型蚤的24 h、48 h、72 h的LC50和EC50值。

在顯微鏡下逐個將懷卵量高的大型蚤揀出，喂以充足的柵藻，在試驗前24 h將幼蚤篩去，并在試驗前6～12 h進行第二次過篩，獲得的幼蚤即為6～24 h蚤齡的幼水蚤，讓幼水蚤再繼續繁殖2 d就可得到出生72 h的試驗水蚤。從中選擇健康、無病菌、有活力、沒有受傷的幼蚤進行急性毒性試驗。

各設置一個空白對照和一系列質量濃度梯度組，用無污染的曝氣自來水作為對照，設2個平行組，取其平均結果。根據預試驗結果，選取PFOA急性毒性試驗的濃度組為15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L，PFOS急性毒性試驗濃度組為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L。試驗先配置儲備液，然后稀釋，使用潔凈的100 mL小燒杯進行大型蚤急性毒性試驗，每個燒杯中放入60 mL試驗溶液，投放15個幼蚤，以在顯微鏡中觀察其心臟停止跳動為終點。試驗期間對照組的大型蚤不活動個數少于10 %，不得出現死亡。

試驗在良好的室內空氣條件下進行，試驗溫度為20±1 ℃，試驗用自來水需經曝氣，靜置去氯。人工配制的標準稀釋水pH值為7.8±0.2，硬度為250±25 mg/L，溶解氧濃度為空氣中飽和值的80%以上。

在試驗中每隔3 h觀察1次，對死亡的大型蚤進行計數，并及時清理死亡的大型蚤及產下的幼蚤，以免影響試驗結果；每隔24 h更換全部試驗溶液一次。為避免影響結果，試驗前24 h停止喂食，試驗期間亦不投喂食。

輕微搖動試驗容器，15 s內不再有活動能力的大型蚤，為活動受抑制的個體；有時大型蚤觸角尚能活動，但是也算作受抑制的個體，而死亡終點為在顯微鏡下觀察其心臟停止跳動。

1.4 數據處理

本研究采用寇式法[12]計算半數致死濃度(LC50)，數據分析處理采用Origin 8.0。寇式法要求最小劑量的反應率(死亡率)為0 %(也即P=0%)，最大劑量的反應率(死亡率)為100%(也即P=100%)。經孫瑞元改進[13]后，在最小劑量時反應率P≤20 %，最大劑量時反應率P≥80 %即可。其計算公式如下：

m=Xk-i(∑P-0.5)

式中:m為lgLC50；i為相鄰兩劑量組之對數差值；Xk為最大劑量組濃度對數值；P為死亡率(%)；Q為存活率(%)，Q=1-P；∑P為各濃度組死亡率之和；n為每組動物數;δm為標準誤差。

lgLC50及其95%置信限為m±1.96×δm，通過對lgLC50及其置信區間取反對數，便可得到半數致死濃度(LC50)及其95%置信限。

2 結果與討論

2.1 暴露于PFOA和PFOS的大型蚤的LC50值

暴露于PFOA和PFOS的大型蚤的LC50值見表1。由表1可以看出：大型蚤暴露于PFOA 24 h時LC50值為366.12 mg/L(95%置信區間為329.12～405.11 mg/L)；大型蚤暴露于PFOA 48 hLC50值為230.35 mg/L(95%置信區間為210.21～243.11 mg/L)。按照化學物質對魚類急性毒性危害分級標準(見表2)，PFOA對大型蚤屬于低毒物質；按照美國華盛頓州化學品毒性分級(見表3)，屬于D級，即最低級毒性物質。大型蚤暴露于PFOA

表1 暴露于PFOA和PFOS的大型蚤的LC50值(mg/L)

注：至試驗結束，對照組大型蚤未出現死亡現象。

表2 化學物質對魚類急性毒性危害分級標準

48 hLC50相比24 hLC50，其值明顯降低，降幅為37.3%，說明PFOA對大型蚤染毒48 h比染毒24 h高出很多；大型蚤暴露于PFOA 72 h時LC50值為102.41 mg/L(95%置信區間為9.32～115.23 mg/L)，為暴露于PFOA 48 h時LC50值的44.5%，顯然毒性作用更大，而相對于24 hLC50值來說，降幅更大，為72.0%。綜上可見，大型蚤暴露于PFOA的毒性效應隨著暴露時間的增加而顯著增加，PFOA對大型蚤屬于低毒物質。

表3 美國華盛頓州化學品毒性分級標準

由表1還可以看出，大型蚤暴露于PFOS 24 h時LC50值為150.34 mg/L(95 %置信區間為132.21～179.03 mg/L)，比暴露于PFOA 24 hLC50值要低很多，為暴露于PFOA 24 hLC50值的41.1 %，說明大型蚤對PFOS的毒性效應更為敏感，PFOS比 PFOA毒性相對而言更大一些。大型蚤暴露于PFOS 48 h時LC50值為120.22 mg/L(95%置信區間為99.32～145.01 mg/L)，比24 hLC50有所降低，說明PFOS對大型蚤的毒性效應隨著暴露時間的增加而加劇，這與PFOA對大型蚤的毒性效應相一致。暴露于PFOS和PFOA 48 hLC50值相差很大，暴露于PFOS 48 hLC50值約為PFOA 48 hLC50值的二分之一，說明暴露48 h時PFOS毒性仍強于PFOA，這與兩者24 h的毒性對比結果相一致。大型蚤暴露于PFOS 72 h時LC50值為70.65 mg/L(95%置信區間為65.32～77.21 mg/L)，為暴露于PFOS 24 hLC50值的47.0%，為暴露于PFOA 72 hLC50值的68.6%。整個PFOS暴露期間，其毒性強度與暴露時間呈正相關關系。按照化學物質對魚類急性毒性危害分級標準，PFOS對大型蚤屬于低毒物質；按照美國華盛頓州化學品毒性分級標準，PFOS屬于最低毒性級別D級。

2.2 暴露于PFOA和PFOS的大型蚤的觀察終點EC50值

表4為暴露于PFOA和PFOS的大型蚤EC50值。由表4可見：大型蚤暴露于PFOA 24 h時EC50值為238.21 mg/L(95%置信區間為201.23～269.12 mg/L)，48 h時EC50值為120.12 mg/L(95%置信區間為100.23～146.31 mg/L)，72 h時EC50值為97.21 mg/L(95%置信區間為90.23～112.55 mg/L)，這說明PFOA對大型蚤的活動抑制程度隨暴露時間的增加而加強，這與致死作用毒性相一致；而暴露于PFOS 24 h時EC50值為90.10 mg/L(95%置信區間為82.32～99.11 mg/L)，48 h時EC50值為35.01 mg/L(95%置信區間為32.34～39.03 mg/L)，72 h時EC50值為28.65 mg/L(95%置信區間為24.12～36.90 mg/L)，說明PFOS對大型蚤的活動抑制程度隨暴露時間的增加而加強，這與表1中LC50數據反映的毒性趨勢相一致。

表4 暴露于PFOF and PFOS的大型蚤的EC50值(mg/L)

注：半數有效濃度的觀察終點為輕微搖動試驗容器，15 s內不再有活動能力的大型蚤，即為活動受抑制個體。

由表1和表4可以看出，PFOS比PFOA對大型蚤表現出更強的抑制作用，在致死效應試驗中，PFOS同樣表現出強于PFOA的毒性，這說明PFOS對大型蚤呈現的毒性大于PFOA。這與多篇關于PCFs毒性效應的文獻的結論相一致，如Olson等[14]用Fisher大鼠研究PFOA的急性毒性表明，PFOS屬于中等毒性化合物，毒性強于PFOA。

國內外研究發現，PFCs的毒性效應主要表現為對肝臟功能[15]、發育過程[16]、免疫系統[17]、生殖系統[18-19]、神經系統[20]、遺傳等的毒性[21]與致癌性[22]。對暴露于PFOA的小鼠研究表明，PFOA可增強小鼠肝臟中酶的活性，使肝臟中的脂肪代謝率升高，并引起生殖與發育毒性[16]。PFCs能夠影響類固醇激素的合成，引起動物的生殖生長和發育的毒性[16,23-25]。如連續暴露于PFOS的雌性大鼠出現發情周期紊亂和內分泌狀態改變的情況，PFOS和PFOA暴露能使大鼠睪丸重量顯著降低，功能受到嚴重影響[26]。PFCs對大型蚤的致死機制可能與PFCs作為表面活性劑的特性有關，表面活性劑都是由親水與親油這兩個基團組成，由于大型蚤體表的皮膚是疏水性的，因此作為表面活性劑的PFCs上的親脂基團能夠對大型蚤的體表產生作用，抑制其游泳能力，并最終引起死亡。還有研究者發現，搖蚊對PFOS的毒性響應比對其他水生生物要高出二三個等級，這可能是因為PFOS與生物體內的血色素相互作用引起的[27]。無論水中的溶解氧量是多少，搖蚊體內的血色素總是維持在一定水平；而水蚤則要在水中的溶解氧明顯下降時才生成血色素，因此推斷PFOS溶于水后可能會降低水中的溶解氧，引起大型蚤出現致死情況。關于PFCs在大型蚤體內的毒性反應機制還未見相關報道，需要做進一步研究。

無論是在大型蚤致死效應試驗中還是在活動抑制試驗中，PFOS均表現出強于PFOA的毒性，該結論與其他相關文獻報道一致[28]，其原因可能是因為兩者的生物蓄積性不同。PFOS和PFOA都可以在水生生物食物鏈中產生明顯的生物蓄積效應[29]，但是通常情況下，PFOS潛在生物累積性更高。如研究表明，人類接觸PFCs的方式有很多種，涉及到飲用水[30]、大氣粉塵[31]和食物[32]等，人類血液中最普遍和濃度最高的PFCs是PFOS，而PFOA濃度相對較低；食物鏈中主要肉食動物、魚類體內PFOS含量很高[33]。根據對大鰭鱗鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)、虹鰭魚(Oncorhynchusmykiss)的研究表明，生物富集系數在其體內分別為2796(整魚)、2900(肝臟)和3100(血漿),最重要的吸收方式是通過魚腮[34]。

3 結 論

(1) PFOA和PFOS對大型蚤均具有急性毒性效應。當大型蚤暴露于PFOA和PFOS 72 h時LC50值分別為102.41 mg/L(95%置信區間為9.32～115.23 mg/L)、70.65 mg/L(95%置信區間65.32～77.21 mg/L)，說明大型蚤對PFOS的毒性效應更為敏感，且72 h內PFOA和PFOS對大型蚤的LC50值均隨暴露濃度的增加及暴露時間的延長而降低。按照魚類生態毒性分級，PFOA和PFOS對大型蚤的毒性等級均為低毒物質。

(2) 按照美國華盛頓州化學品毒性分級標準，PFOA和PFOS均屬于D級，即最低級毒性物質。暴露于PFOA和PFOS的大型蚤的觀察終點EC50值表明，PFOA和PFOS對大型蚤的活動抑制程度均隨暴露時間增加而加強，這與本研究得出的LC50值結果一致，且PFOS比PFOA對大型蚤表現出更強的抑制作用。可見，無論在大型蚤致死效應試驗中還是在活動抑制試驗中，PFOS的毒性均強于PFOA。

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Experiment Study on Acute Toxicity of PFOA and PFOS toDaphniaMagna

LIU Ran1,CAO Zhihui2,3,ZHAO Yue2,3,WANG Bing2,3,SHEN Hongyan2,3,YANG Jiepin2,3

(1.EnvironmentalEngineeringAssessmentCenterofHebeiProvince,Shijiazhuang050051,China;2.SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang050080,China;3.MedicalMolecularChemistryLabofHebeiProvince,Shijiazhuang050080,China)

This paper uses static exposure method to study the acute toxicity of perfluorooctanoic acid (PFOA) and perfluorooctane sulfonate (PFOS) toDaphniamagna.The results show that both the two typical perfluorinated surfactants have acute toxicity effects onDaphniamagna.The 72 hLC50of PFOA and PFOS toDaphniamagnais 102.41 mg/L (95% confidence interval is 9.32～115.23) and 70.65 mg/L (95% confidence interval is 65.32～77.21)respectively.This indicates thatDaphniamagnais more sensitive to the toxic effect of PFOS than that of PFOA.And theLC50values of PFOS and PFOA toDaphniamagnadecrease with the increase of the exposure concentration and the extension of exposure time during 72 h.According to the classification of fish ecotoxicity,PFOS and PFOA are low toxic substances toDaphniamagna.And on the basis of the chemical toxicity grading in Washington State,USA,these two substances belong to D class which are the lowest toxic substances.The endpointEC50ofDaphniamagnaexposed to PFCs indicates that the activity inhibition ofDaphniamagnaincreases with the increase of the exposure concentration,which is consistent with the result ofLC50obtained from this study.Also PFOS shows a stronger inhibitory effect onDaphniamagnathan PFOA does.The research results above show that PFOS has stronger toxicity than PFOA does whether in lethal effect test or in activity inhibition test toDaphniamagna.

perfluorooctanoic acid(PFOA);perfluorooctane sulfonate(PFOS);Daphniamagna;acute toxicity experiment;Karber method

1671-1556(2015)04-0051-05

2014-11-16

2015-05-10

國家自然科學基金項目(41373096)；國家環保公益基金項目(201509041-05)；河北省自然科學基金項目(B2014208068)；河北省藥用分子化學實驗室開放基金項目；河北省環保廳公益課題項目；河北省重點學科建設基金項目

劉 冉(1986—)，男，助理工程師，主要從事建設項目環境影響評估和污染物環境行為及效應等方面的研究工作。E-mail:461104001@qq.com

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10.13578/j.cnki.issn.1671-1556.2015.04.009

沈洪艷(1971—)，女，博士，教授，主要從事污染物環境行為及效應等方面的研究。E-mail:shy0405@sina.com