PDGF-BB對大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞增殖和細胞周期的影響

羅金泰余文俊韋安陽袁 堅曾國華

1. 廣州醫科大學第一附屬醫院微創外科中心泌尿外科（廣東省泌尿外科重點實驗室）（廣州 510230）；2. 南方醫科大學南方醫院惠僑樓泌尿外科

PDGF-BB對大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞增殖和細胞周期的影響

羅金泰1*余文俊1韋安陽2袁 堅1曾國華1

1. 廣州醫科大學第一附屬醫院微創外科中心泌尿外科（廣東省泌尿外科重點實驗室）（廣州 510230）；2. 南方醫科大學南方醫院惠僑樓泌尿外科

目的 探討血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）對大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞（CCSMC）增殖和周期的影響。方法 使用改良組織塊貼壁法原代培養大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞，將細胞分為空白對照組和不同濃度PDGF-BB處理組，分別采用MTS法和流式細胞術檢測PDGF-BB對CCSMC增殖和周期的影響。結果 MTS法提示PDGF-BB促進CCSMC增殖，且在一定時間范圍和濃度范圍內分別呈時間依賴和濃度依賴；流式細胞術結果顯示PDGF-BB作用后G0/G1期細胞由（90.79±3.46）%減少至（77.57±5.72）%；而S期的細胞由（7.85±2.68）%升高至（16.47±4.42）%；G2/M期由（2.46±1.25）%升高至（5.96±2.18）%，兩組間差異具統計學意義（P＜0.05）。結論 PDGF-BB可促進大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞增殖。

血小板源性生長因子； 肌細胞，平滑肌； 細胞增殖； 細胞周期

血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是體內一種強效促有絲分裂劑，在細胞的增殖、分化、組織損傷的修復及動脈粥樣硬化斑塊形成中起重要作用。PDGF對血管平滑肌細胞相類似的陰莖海綿體平滑肌細胞（corpus cavernosum smooth muscle cell，CCSMC）是否有促進其增殖的作用，目前尚不清楚。本研究將探討PDGF-BB對促進CCSMC增殖的影響。

材料與方法

一、材料

SD大鼠購于廣東省實驗動物中心，DMEM培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司，PDGF-BB購于美國R&D公司，MTS購于美國Premoga公司。

二、方法

（一）CCSMC原代培養

采用改良組織塊法原代培養CCSMC，選取200g左右7周齡雄性SD大鼠1只（清潔級），斷頸椎處死大鼠，以75%酒精浸泡大鼠約3 min。在無菌條件下快速切開包皮，在陰莖腳水平橫行切取陰莖，迅速移入含有雙抗的PBS緩沖液中，去除陰莖軟骨、尿道、纖維、脂肪及血管等組織。經PBS漂洗2次洗去血細胞后，將海綿體組織剪成（0.5～1）mm3組織塊，按0.5 cm的間隔放置到涂有含20%胎牛血清的DMEM/ F12培養基的25 mL培養瓶內，再將培養瓶翻轉使組織塊位于上方，5 h后翻轉培養瓶，使組織塊與培養基接觸，在37℃、5%CO2、95%空氣的培養箱中培養。4 d左右見有細胞從組織塊爬出，遂剔除組織塊。細胞融合至約90%時用胰酶消化細胞，后加入含10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，制成單細胞懸液，靜置20min后將細胞懸液轉移至另一個培養皿中，再次靜置、貼壁，如此重復兩次后，將培養皿放入37℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞融合至約90%時，按1:3傳代培養。

（二）CCSMC鑒定

1. 細胞形態學觀察：倒置顯微鏡下觀察細胞大小、形態和生長特點等。

2. α- SMA免疫熒光染色：將約1×105個細胞接種于含無菌載玻片的12孔板中，培養細胞至80%～90%融合后，棄去培養基，PBS洗滌5min×3次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌5min×3次，0.3%Triton X-100破膜3min，PBS洗滌5min×3次，5%BSA封閉45min，吸去BSA，SMA一抗（1:200稀釋）4℃孵育過夜，PBS洗滌5min×3次，熒光二抗（1:200稀釋）避光室溫孵育45min，PBS洗滌5min×3次， DAPI染核，PBS洗后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

（三）實驗分組

原代培養的2-4代大鼠CCSMC用于實驗。實驗分為空白對照組和不同濃度（5、10、20、40ng/mL）PDGF-BB組，不同濃度PDGF-BB作用細胞24h。以及空白對照組和20ng/mL PDGF-BB作用細胞不同時間（24、48、72h）組。

（四）MTS法檢測細胞增殖能力

將制備的CCSMC懸液接種在96孔培養板中，每孔接種含5×103個細胞的培養液100μL。經CO2培養箱孵育24 h，換無血清的DMEM培養液同步化細胞24 h，分為1%FBS培養基空白對照組及1%FBS培養基加不同濃度PDGF-BB（5、10、20、40ng/mL）的各組，每組設5個復孔，分別繼續培養1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，行MTS檢測，每孔加入MTS20μL，于37℃、5% CO2培養箱內孵育4h后，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定各孔吸光值，記為A490。

（五）流式細胞術檢測細胞周期

處于對數生長期的細胞，用無血清培養基培養24h，使細胞同步化，再將其分為空白對照組與20ng/mL PDGF-BB處理組繼續培養24h，消化細胞，離心及PBS漂洗，75%冰乙醇中固定，4℃過夜，次日離心并用PBS漂洗，棄上清液后每管加500μL PBS，25μL PI，2.5μL RnaseA溶液，37℃水浴1h，300目濾網過濾后上機檢測。

三、統計學處理

數據采用SPSS 13.0統計軟件進行處理，計量資料用均數±標準差表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多樣本均數兩兩比較采用單因素方差分析。

結 果

一、陰莖海綿體平滑肌細胞生長情況及鑒定

倒置相差顯微鏡觀察：原代培養第4天，可見少許CCSM從組織塊邊緣爬出，形態多樣，大部分呈梭型，見圖1A。當細胞生長至融化后，部分區域呈多層重疊，部分呈單層，高低起伏，呈現平滑肌細胞特征性的“峰-谷”樣生長，見圖1B。α-SMA免疫熒光鑒定：熒光顯微鏡下可見綠色熒光分布在胞核和胞漿中，陽性率達95%以上，見圖1C。

圖1 CCSMC生長情況及鑒定A: CCSMC從組織塊中爬出（×40）； B: CCSMC呈“峰-谷”樣生長（×100）； C: CCSMC免疫熒光染色α-SMA陽性表達（×200）

二、PDGF-BB對CCSMCs增殖的影響

MTS結果顯示，與對照組相比，PDGF-BB刺激后，CCSMCs增殖能力均增強，隨著時間的增加，增殖能力逐漸增強，第5天達到峰值，隨后增殖能力開始減弱，在一定時間范圍內呈時間依賴；一定濃度范圍內PDGF-BB刺激后CCSMCs增殖能力隨濃度增加而增強，呈濃度依賴，20ng/mL PDGF為峰濃度，與其他組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 PDGF-BB對CCSMCs增殖的影響MTS檢測不同濃度（0、5、10、20、40ng/mL）PDGF-BB作用CCSMCs不同時間（1～7d）后細胞的增殖情況。第5天達到增殖高峰，20ng/mL PDGF為峰濃度

三、PDGF-BB對CCSMCs周期的影響

流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較G0/G1期細胞由（90.79±3.46）%減少至（77.57±5.72）%；而S期的細胞由（7.85±2.68）%升高至（16.47±4.42）%；G2/M期由（2.46±1.25）%升高至（5.96±2.18）%，兩組間差異顯著（P＜0.05），見圖3。

討 論

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是中老年男性的常見病、多發病。近年來，隨著生活、工作、心理等各方面的壓力逐步加大，ED的患病率呈現不斷增高并出現年輕化的趨勢。ED的發生發展是一個多因素、多步驟的復雜過程。目前ED的具體發病機制尚不明確，有研究表明低氧與ED有著密切的關系，認為低氧引起ED的機制主要是海綿體纖維化學說，而另一種可能機制是產生引起血管緊張度增加的各種因子，如血小板源性生長因子、血管內皮素和血管內皮生長因子等［1，2］。有學者采用大鼠海綿體體外模擬低氧環境，發現短暫的低氧能夠導致大鼠海綿體PDGF及其受體過表達，長期則會導致海綿體纖維化［3］。

PDGF是一類強有效的促有絲分裂劑和化學誘導劑［4］。PDGF有5種亞型，分別為PDGF-AA、PDGFAB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD，其中PDGFBB被認為是其家族中促進有絲分裂能力最強的成員。PDGF必須與細胞表面相關受體結合后，才能激活胞內信號傳導通路，通過自分泌或旁分泌的方式發揮生物學效應，參與胚胎發育、組織修復、正常生理活動及多種疾病（如纖維增生性疾病、動脈粥樣硬化和腫瘤）的發生發展等多項生命活動［5-8］。目前己發現多條相關信號傳導路徑［9，10］，如ERK通路，PI3K/ Akt通路，MAPK通路，PLC通路，Src通路，Ca2+通路，JAK/STAT通路，PKA通路，G蛋白耦聯受體等。以上多種信號傳導途徑相互聯系，形成一個龐大而復雜的信號網絡，共同調節PDGF對細胞的作用。

PDGF-BB是否可以促進CCSMC增殖目前未見報道，本文是首次報道PDGF-BB對CCSMC增殖的影響。本研究通過MTS檢測PDGF-BB對CCSMC增殖的影響。MTS結果提示PDGF-BB的作用在一定時間范圍和濃度范圍內分別呈時間依賴和濃度依賴，PDGFBB刺激后第5天達到增殖高峰而后細胞逐漸凋亡，20ng/mL PDGF-BB為促增殖的峰濃度。

圖3 PDGF-BB對CCSMCs周期的影響A: 對照組流式細胞檢測細胞DNA直方圖； B: PDGF組流式細胞檢測細胞DNA直方圖； C: PDGF-BB作用后CCSMC細胞周期的變化情況， 細胞經過PDGF-BB作用后G0/G1期細胞減少， S期細胞增加， G2/M期增加，*P＜0.05 與對照組比較

同時，為進一步探討PDGF-BB促陰莖海綿體平滑肌細胞增殖的可能作用機制。本研究還應用流式細胞儀觀察PDGF-BB對細胞DNA合成和細胞周期的影響。G1為DNA合成前期，此期為過渡至S期作準備，發生的是與DNA合成有關的生化變化；S期為DNA合成期，可反映細胞的分裂活力，增殖旺盛的細胞處于S期的比例較高；G2為DNA合成后期，M期為有絲分裂期，（S+G2M）%為增殖指數，代表了細胞中增殖細胞的數量，在一定程度上反映細胞的增殖狀態。本實驗結果顯示，PDGF-BB處理組G1期細胞減少，S期與G2/M期細胞增多，其可能作用機制是促使靜止態的G1期細胞活躍而向S期轉變，使DNA合成量增加，從而促進細胞的增殖。實驗結果進一步驗證了PDGFBB作用后CCSMC處于增殖狀態。

通過以上研究證實PDGF-BB可促進大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞增殖，然而其具體機制仍不清楚，有待進一步深入研究，為ED發病機制的明確和疾病的治療提供理論基礎。

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（2015-05-25收稿）

The effects of PDGF-BB on cell proliferation and cell cycle of corpus cavemosum smooth muscle cells in SD rat

Luo Jintai1*， Yu Wenjun1， Wei Anyang2， Yuan Jian1， Zeng Guohua1
1. Department of Urology， Minimally Invasive Surgery Center， The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University. Guangdong Key Laboratory of Urology， Guangzhou 510230， Guangdong， China
2. Division of Urinary Surgery， Huiqiao Department， Nanfang Hospital， Southern Medical University

Luo Jintai， E-mail: 2961944548@qq.com， Tel: 13922449294

Objective To evaluate the effect of the platelet-derived growth factor-BB （PDGF-BB） on cell proliferation and cell cycle of corpus cavemosum smooth muscle cells （CCSMCs） in SD rat. Methods CCSMCs were primarily cultured and subjected to immunocytochemical assay. The cells were divided into different concentrations of PDGF-BB groups and a nromal control group. The MTS method and fi ow cytometry were used respectively to detect cell proliferation and cycle. Results MTS analysis suggested PDGF-BB increased CCSMC proliferation， and exhibited time dependent and concentration dependent mode； Flow cytometry results showed that the proportion of cells in G0/G1 phase decreased from（90.79±3.46）% to （77.57±5.72）%； And the proportion of cells in S phase was increased from （7.85±2.68）% to （16.47±4.42）%；G2/M phase cells from （2.46±1.25）% to （5.96±2.18）%， there were signifi cant differences between the two groups （P＜0.05）. Conclusion PDGF-BB may promote rat corpus cavernosum smooth muscle cell proliferation.

platelet-derived growth factor； myocytes， smooth muscle； cell proliferation； cell cycle

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.006

R 698.1

*通訊作者， E-mail: 2961944548@qq.com， Tel: 13922449294