HHcy大鼠tHcy與陰莖海綿體內NOS和H2S的相關性研究*

桂士良騰 飛曹會峰遲寶進

羅振國2郭玉剛2杜叢林2崔大偉2吳長利1**

1. 天津醫科大學第二醫院泌尿科（天津 300211）；

2. 佳木斯大學附屬第一醫院； 3. 吉林醫藥學院附屬醫院

HHcy大鼠tHcy與陰莖海綿體內NOS和H2S的相關性研究*

桂士良1，2△騰 飛3△曹會峰2遲寶進2

羅振國2郭玉剛2杜叢林2崔大偉2吳長利1**

1. 天津醫科大學第二醫院泌尿科（天津 300211）；

2. 佳木斯大學附屬第一醫院； 3. 吉林醫藥學院附屬醫院

目的 探討甜菜堿（Betaine， Bet）對高同型半胱氨酸血癥（HHcy）大鼠血漿總同型半胱氨酸（tHcy）及陰莖海綿體內一氧化氮合酶（NOS）、硫化氫（H2S）及勃起功能的影響。方法 選用Wistar雄性大鼠45只，隨機選出10只為對照組（A）。其余用3%蛋氨酸喂養，造模成功后的30只，隨機分為：高同型半胱氨酸組（B）、鹽酸甜菜堿治療組（C）、葉酸、維生素B12治療組（D）。A組給予正常飼料；B組3%蛋氨酸喂養。C組、D組，在喂養3%蛋氨酸的同時，分別給予Bet和葉酸、維生素B12灌胃。4周后，進行APO實驗、大鼠陰莖海綿體內壓（ICP）的測定、檢測tHcy濃度及陰莖海綿體內NOS活性及H2S濃度。結果 與A組比較，B組tHcy升高、陰莖海綿體內NOS活性及H2S濃度降低，ICP壓力減低，勃起次數減少，有差異性，具統計學意義（P＜0.05）。C、D組與B組比較，tHcy降低、陰莖海綿體內NOS活性及H2S濃度增高，ICP壓力增高，勃起次數增多（P＜0.05），同型半胱氨酸（Hcy）與NOS（rA=-0.857、rB=-0.976 、rC=- 0.903、rD=-0.847）和H2S（rA=-0.857、rB=-0.976、rC=- 0.903、rD=-0.847）均成負性相關。C組與D組比較，tHcy降低、陰莖海綿體內NOS活性及H2S濃度升高，ICP壓力增高，勃起次數增加，差異具統計學意義（P＜0.05）。結論 tHcy升高影響陰莖海綿體內NOS活性及H2S濃度的降低是引發勃起功能障礙（Erectile dysfunction ，ED）的機制之一。Bet是治療HHcy所致ED的有效藥物之一。

甜菜堿； 高同型半胱氨酸血癥； 硫化氫； 一氧化氮合酶； 勃起功能障礙

高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocystinemia，HHcy）是指空腹狀態下血漿總的同型半胱氨酸（tHcy）濃度大于15μmol/L。為心、腦血管疾病及外周血管類疾病的危險因素之一［1］。男性tHcy濃度大于女性，且患HHcy的概率明顯較女性高。陳慶軍等［2］研究HHcy大鼠時，發現HHcy與勃起功能障礙（ED）有關，并提出HHcy是ED的獨立危險因素。所以，我們觀察HHcy狀態下大鼠陰莖海綿體內一氧化氮合酶（NOS）活性及硫化氫（H2S）的變化以及其對勃起功能的影響，并給與甜菜堿（Betaine， Bet）進行干預治療。本文意在對HHcy進行Bet干預治療，以觀察tHcy和大鼠陰莖海綿體內NOS活性及H2S的變化以及其對勃起功能的影響。

材料與方法

一、實驗動物及模型建立

HHcy大鼠動物模型的建立：用Wistar雄性大鼠純系2月齡雄性45只（佳木斯大學動物實驗中心提供），體質量280g～310g。適應性喂養1周后，隨機取10只為對照組（A組）給予正常飼料喂養。 余35只給予3%蛋氨酸飼料4周后，取血檢tHcy濃度，tHcy濃度＞（24.15±0.96）μmol/L，即為造模成功。將造模成功的大鼠隨機分成3組：（1）HHcy大鼠模型組（B組） 繼續給予3%蛋氨酸飼料喂養；（2）HHcy大鼠Bet治療組（C組） 繼續給予3%蛋氨酸飼料喂養，每天定時按照60 mg/（kg?d）的劑量給與Bet，0.3mL水溶液灌胃4周；（3）HHcy大鼠葉酸、B12 治療組（D組） 給予3%蛋氨酸飼料喂養，且定時給予葉酸 0.5mg/（kg?d）和B12 0.2mg/（kg?d），0.3mL水溶液灌胃。A、B組則給予生理鹽水0.3 mL灌胃4周。

二、方法

（一）Hcy測定

大鼠內眥靜脈采血，分離血漿，采用酶聯免疫法（ELISA）測定各組的tHcy含量。試劑盒（上海豐翔生物科技公司提供），嚴格按照說明書操作

（二）阿樸嗎啡實驗（APO）

擇一安靜的實驗室，分組將每只大鼠置于玻璃器皿中，在頸項背部皮下注射阿樸嗎啡（Sigma公司）100μg/ kg。注射后觀察30 min，并予以記錄A、B、C、D組陰莖勃起次數。陰莖頭充血及末端陰莖體露出為勃起1次。

（三）大鼠陰莖海綿體內壓（ICP）的測定

用戊巴比妥鈉（35mg/kg）腹腔注射麻醉，正中切口，分離下腹下神經及盆神經和海綿體神經通過電極刺激海綿體神經。參數：頻率：2ms，強度：5V，波寬：25Hz，持續時間：1min，間隔5min，共3次。

（四）大鼠陰莖海綿體NOS的測定

勻漿陰莖海綿體后，取上清液，用ELISA法測定各組NOS水平，試劑盒購自（上海豐翔生物科技公司），嚴格按照說明書進行操作。

（五）統計學分析

實驗數據采用SPSS17.0統計軟件包處理，結果以均數標準差（±s）表示，組間比較行方差分析及t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、HHcy大鼠模型的建立

3%蛋氨酸飼料喂養4周后，通過檢測tHcy濃度和APO實驗建立模型組。A、B兩組tHcy濃度和APO實驗。進行蛋氨酸飼養四周后，B組大鼠的勃起次數低于正常組，tHcy濃度明顯高于正常組，有統計學差異（P＜0.05）； B組大鼠ICP測定值明顯低于正常組，C組、D組ICP測定值與B組比較ICP值升高（P＜0.05）；B組與A組比較勃起功能下降，（P＜0.05）。C組、D組與B組比較勃起功能提高（P＜0.05）。與B組比較，C組、D組大鼠tHcy濃度下降（P＜0.05），陰莖海綿體內NOS活性、H2S含量升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠勃起次數、ICP 、tHcy 、NOS、H2S的測定結果。

二、各組大鼠tHcy和陰莖海綿體內NOS、H2S含量數值與H2S進行線性相關性分析

大鼠tHcy水平和陰莖海綿體內NOS、H2S含量成負性相關，見表2。

表2 4組大鼠tHcy值與ICP相關性分析的相關系數

討 論

HHcy是心血管疾病的獨立致病因素之一，有研究表明［2］，高蛋白，高糖飲食可以引起HHcy。HHcy不僅能降低內皮細胞功能，并可以誘導血管平滑肌細胞增生，使血管硬化，促使內皮小血栓形成，還可以誘導巨噬細胞吞噬低密度脂蛋白，加重粥樣硬化，進而導致ED［3］，本實驗結果中，HHcy大鼠勃起次數減少、ICP降低，證實了上述的理論。目前的研究提示［4］，陰莖的勃起是陰莖海綿體內的血管在神經和體液系統的調節下進行的血流動力學改變的結果。NO在這個過程中擔任重要的信使作用［5］，是在NOS的調解下通過L-Arg-NO-cGMP途徑實現的。桂士良等［6］在研究糖尿病HHcyED大鼠時，發現高同型半胱氨酸血癥的大鼠的陰莖海綿體中的NOS的含量減少。由此可見，HHcy可以導致陰莖海綿體中NO含量下降，繼而影響陰莖的勃起。

H2S是繼NO和CO后的又一種氣體信號分子。在人體中，H2S以結合形式存在是少于1/5的，余下的則以硫氫化鈉（Sodium hydrosulfide，NaSH）的形式存在。NaSH既能水解又可以與H+結合，達到既可以維持在人體中的正常濃度，又可使內環境及pH值平穩的作用。因其具有較強的脂溶性，可以穿過細胞膜［7］，所以具有NO，CO類似的生理作用。H2S可以在細胞間傳遞信息，通過各種調節和信號傳導方式引起血管的舒張和平滑肌的松弛［8］。H2S作為第三種氣體信號分子，對心血管具有保護作用。同時與Hcy聯系緊密。 可以保護蛋氨酸代謝過程中Hcy所引起的血管內皮損傷，并對Hcy所引起的細胞損害也具有保護作用。在人體中正常范圍中的H2S對血管內皮系統和平滑肌系統同樣有調節作用，與NO，CO關系密切。H2S與NO，CO一樣在調節陰莖勃起過程中，也擔任著重要的角色［9-11］。有實驗［12］將大鼠的主動脈和硝普鈉一起孵育后，證明H2S濃度依賴于硝普鈉的濃度增加。再應用鳥苷酸環化酶抑制劑后，給予硝普鈉，則H2S減少。在給予左旋精氨酸抑制劑后，發現大鼠血壓增高，CSE的活性下降，血漿中的H2S濃度降低。因此，推測NO對H2S的調節主要是通過cGMP途徑，實現對CSE的調節的，NO可以直接增加CSE的轉錄，增加表達，增強其的活性。當大鼠肺動脈高壓時，有人發現H2S/CSE與NO/NOS的作用為負性調節［13］。這就說明，NO和H2S之間的相互作用很復雜，需要進一步研究。

隨著對ED和陰莖勃起理論研究逐步深入，Srilatha等［14］提出H2S在陰莖勃起中有和NO、CO相似的作用；陰莖海綿體可以將Hcy轉化為H2S，進而達到促進陰莖勃起的作用。這表明H2S在陰莖勃起中亦擔任著信使的作用。本實驗中觀察到大鼠陰莖海綿體中H2S濃度的降低與tHcy有相關性。提示陰莖海綿體中H2S濃度的降低可能是HHcy所致ED的發病機制之一。

Bet作為藥物單獨或聯合其他藥物治療HHcy已經應用于臨床多年。本研究在Bet能否改善HHcy所致的ED方面進行了嘗試。有學者研究2型糖尿病大鼠時，發現HHcy與勃起功能障礙有關，并提出HHcy是勃起功能障礙的發病機制之一［6］。Bet可以有效的降低HHcy伴高尿酸癥患者的tHcy濃度［15］。減輕了HHcy對血管系統，血管內皮系統和神經系統的影響［16］。從而達到改善HHcy所致ED的陰莖勃起功能的效果。本試驗中觀察到，Bet在治療HHcy所致的ED方面優于葉酸、維生素B12 。

綜上所述，本研究表明HHcy大鼠tHcy與陰莖海綿體內NOS和H2S的具有相關性，Bet在治療高蛋氨酸飲食引起HHcy的陰莖勃起功能下降時效果優于葉酸、維生素B1，可能是治療HHcy所致的陰莖勃起功能下降的有效手段之一。

1 Kanth VV， Golla JP， Sastry BK， et al. Genetie interactions between MTHFR（C677T）， methionine（A2756G， C2758G）varian with vitamin B12 and folic acid determine susceptibility to premature coronary artery disease in Inian population. J Cardiovase Dis Res 2011； 2（3）: 156-163

2 陳慶軍， 曹會峰， 張東升， 等. HHcy大鼠陰莖海綿體內NOS和CO含量的研究. 中華男科雜志 2008； 14（8）: 701-703

3 Hosoki R， Matsuki N， Kimura H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide. Biochem Biophys Res Commun 1997； 237（3）: 527-531

4 Factor SH. More study needed on morning erections and erectile dysfunction. Am J Med 2009； 122（2）: e5

5 Sweazea K，Wslker BR.Antioxidant and vasodiatory effects of heme oxygenase on mesenteric vasoreactivity following chronic hypoxia. Microcirculation 2009； 16（2）: 131-141

6 桂士良， 曹會峰， 遲寶進， 等. 2型糖尿病大鼠血漿同型半胱氨酸與陰莖海綿體內NOS和內源性CO的相關性研究. 中華男科學雜志 2012； 18（2）: 126-129

7 Hu X， Li T， Bi S， et al. Possible Role of Hydrogen Sulfi de on the Preservation of donor rat heart. Transplant Proc 2007； 39（10）: 3024-3029

8 Wang R. Two's company. three's a crowd :can H2S be the third endogenous Gaseous transmitter. FASEB J 2002；16（13）: 1792-1798

9 Al-Hunayan A， Thalib L， Kehinde EO， et al. Hyperhomocy-terinemia is a risk factor for erectile dysfuction in men with adultonset diabetes mellitus. Urology 2008； 71（5）: 897-900

10 Szele FG， Murphy DL， Garrick NA. Effects of fenfi uramine，chloral phenyl piperazine， and other serotonin-related agonists and antagonists on penile erections in nonhuman primates. Life Sci 1988； 43（16）: 1297-1303

11 Pearson RJ， Wilson T，Wang R. Endogenous hydrogen sulfi de and the cardiovascular system: What's the smell all about？ Clin Invest Med 2006； 29（3）: 146-150

12 Zhao W， Zhang J， Lu Y， et al. The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener. EMBO J 2001； 20（21）: 6008-6016

13 張清友， 杜軍保， 張春雨， 等. 內源性一氧化氮對低氧大鼠肺動脈硫化氫胱硫醚-γ-裂解酶體系的影響. 實用兒科學臨床雜志 2003； 18（11）: 865-867

14 Srilatha B， Adaikan PG， Li L， et al. Hydrogen sulfi de: A novel endogenous gasotransmitter facilitates erectile function. J Sex Med 2007； 4（5）: 1304-1311

15 Olthof MR， Verhoef P. Effects of betaine in take on plasma homocysteine concentrations and consequeces for health. Curr Drug Metab 2005； 6（1）: 15-22

16 Craig SA.Betaine in human nutrition. Am J Clin Nutr 2004； 80（3）: 539-549

（2015-06-02收稿）

Relevance study of total homocysteine to NOS and endogenous H2S in penile corpus cavernosum of hyperhomocystinemia rats*

Gui Shiliang1，2△， Teng Fei3△， Cao Huifeng2， Chi Baojin2，Luo Zhenguo2， Guo Yugang2， Du Conglin2， Cui Dawei2， Wu Changli1**
1. Department of Urology， the Second Affi liated Hospital Tianjin Medical College，Tianjin， 300211， China； 2. Department of Urology， the First Affi liated Hospital， Jiamusi University； 3. The Affi liated Hospital， Jilin College of Pharmacy Corresponding author: Wu Changli， E-mail: wucl2003@163，com

Objective To study the effects of Bet on erectile function by total homocysteine， NOS and endogenous H2S in penile corpus cavernosum of hyperhomocystinemia rats. Methods Forty-fi ve Wistar male rates were included in the study. Ten of them were randomly selected as the control group （group A ； n=10） and were normally fed. To develop HHcy rats， other rats were fed with 3% methionine diet， then 30 rats of them were randomly divided into three groups as follows: HHcy rats group （group B， n=10）， Betaine treated group （group C， n=10） and folic acid and vitamin B12 treated group （groupD， n= 10）. Four weeks later， ICP were examined， and the levels of the total plasma homocysteine were measured using cycle enzyme， additionally， NOS activity and H2S concentration was examined in penile homogenate. Results Compared with that of group A， the level of plasma tHcy significantly was increased in group B， but the NOS activity and H2S concentration in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were decreased signifi cantly （P＜0.05）. Compared with that of group B， the level of plasma tHcy was signifi cantly decreased in group C and group D， but the NOS activity，H2S concentration in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were signifi cant increased （P＜0.05）， moreover，tHcy was negatively correlated with NOS activity （rA= -0.857， rB= -0.976， rC= - 0.903， rD= -0.847） and H2S concentrations （rA= -0.857， rB= -0.976， rC= -0.903， rD= -0.847）， respectively. Compared with that of group D， the level of plasma tHcy in group C signifi cantly decreased， whereas， the NOS activity， H2S concentrations in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were also decreased （P＜0.05）. Conclusion High level of plasma tHcy， and low NOS activity and H2S level in the penile corpus cavernous may result in the ocurrence of ED. Betaine may be an effective agent that improves the erectile dysfunction.

Betaine； Hyperhomocystinemia； Hydrogen sulphide； Nitric oxide synthetase； erectile dysfunction

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.003

R 698.1

△并列第一作者

資助: 黑龍江省自然科學基金（項目編號：H2015073）； 黑龍江省教育廳科學技術研究項目（項目編號：12521542）； 佳木斯大學重點項目（項目編號：Sz2013-005）

**通訊作者， E-mail: wucl2003@163，com