植物乳桿菌在馬鈴薯秧藤汁液中的適應性馴化培養研究

張雄杰等

摘要 將一株高產酸植物乳桿菌，在含有馬鈴薯秧藤汁液的一組MRS液體培養基中連續轉移接種培養，組內5個培養基中的秧藤汁液濃度呈階梯性遞增狀態，對完成連續馴化培養后的菌種進行冷凍干燥保存。進一步將該馴化菌和未馴化菌進行同步解凍激活后，分別接入含有馬鈴薯秧藤固體顆粒的液體培養基中培養48 h，結束后分離出各自培養基中的馬鈴薯秧藤固體顆粒部分和液體部分，采用比色法分別測定固體和液體部分中糖苷生物堿的含量；分別測定液體部分的pH值和總細菌細胞數。結果表明：在馴化菌的培養體系中，總細菌細胞數含量顯著高于對照組；pH值顯著低于對照組；馬鈴薯秧藤固體顆粒中糖苷生物堿含量明顯低于對照組；培養液中的糖苷生物堿顯著高于對照組。

關鍵詞 馬鈴薯秧藤；植物乳桿菌；糖苷生物堿；青貯飼料

中圖分類號 S816.5+3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）14-0269-03

Study on the Cultivation of Lactobacillus of Adaptive Acclimation to the Juice of Potato Cane

ZHANG Xiong-jie 1 LU Peng-fei 2 CHEN Hao 3 LI Zhi-qiang 3 LIU Quan-guo 3

（1 Innner Mongolia Horizon Oasis Research Center of Characteristic Biologic Resource，Hohhot Innner Mongolia 010018；

2 Inner Mongolia Agriculture University； 3 Innner Mongolia Greed Seed industry of Potato Co.，Ltd）

Abstract In the experiment，the plant lactobacillus which have high acid production was transferred into a group of MRS liquid nutrient medium for the continuous transfer and cultivation，In this group of 5 liquid medium the juice of potato cane was the ladder of increasing state.Then，the freeze drying of the strains after continuous cultivation was carried out.Further，after thawing activation of the domesticated bacteria and not domesticated bacteria synchronously，They were inoculated to the liquid nutrient medium which included the juice of potato cane cultivate 48 h.After the training the potato cane solid particles and liquid parts in the medium was each separated.The contents of the Glycosides alkaloids in the solid and liquid parts were determined respectively by colorimetric method；pH values and total bacterial count were determined in the liquid parts.The results showed that in the cultivation system of the domesticated bacteria，the total bacterial cell number was significantly higher than that of the control group；pH value was significantly lower than that of the control group；Glycosides alkaloids content in the potato cane solid particles was significantly lower than that of the control group；Glycosides alkaloids in the liquid were significantly higher than those in the control group.

Key words potato cane；Lactobacillus plantarum；Glycosides alkaloids；silage

馬鈴薯秧藤是馬鈴薯植株的地上部分，是在收獲塊莖后剩余的副產品。在傳統的馬鈴薯種植業中，秧藤一般作為廢棄物被處理；在現代化的馬鈴薯種植業中，為促進塊莖薯皮提早老化、便于機械收獲土豆作業以及預防各類病原體傳播，一般在土豆收獲前幾天至十幾天，采用化學殺秧、機械打秧等方式，將秧藤打碎還田或清除出田地的田間管理措施，這使得馬鈴薯秧藤資源具有了容易收集、分布集中、數量龐大的可開發利用優勢。研究表明，馬鈴薯秧藤不僅可以作為還田綠肥、青貯飼料[1-4]，而且馬鈴薯秧藤中含有的70余種生物活性物質[5-9]糖苷生物堿、茄尼醇、揮發油等均是具有開發價值的化工醫藥原料，具有很好的開發前景，但目前國內尚無成熟的綜合開發利用技術。endprint

鑒于秧藤生物堿在青貯壓實操作中有一部分進入自由流動的汁液浸出，且生物堿能夠溶于稀酸溶液的特點，在馬鈴薯秧藤綜合開發利用中，一方面需要將秧藤青貯發酵產酸，使有害生物堿被乳酸溶解并隨汁液脫出；另一方面要求溶出后進入汁液里的生物堿不被降解，能被進一步提取利用。選擇高產酸性能的植物乳桿菌，更有利于促進這一過程。為此，需要對選定的高產酸性能的植物乳桿菌，在馬鈴薯秧藤汁液中進行適應性馴化培養。為此，開展了本研究工作，旨在為緩解馬鈴薯集中種植區（多為農牧交錯地區）青貯飼料匱乏的問題，尋找一條具有高附加值的馬鈴薯秧藤生物活性物質提取加工路徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 馬鈴薯秧藤及汁液。鮮秧藤均采自內蒙古格瑞得馬鈴薯種業公司種植的種薯大田，品種為大西洋、費烏瑞它、克新1號、荷蘭十五及布爾班克；汁液在使用前用壓榨器取得；秧藤及汁液在加入培養基前預先滅菌處理。

1.1.2 儀器及試劑。試驗在內蒙古農業大學生命科學院實驗室進行。主要儀器：常規微生物實驗儀器；主要試劑：四氫呋喃∶水∶乙腈∶乙酸（50∶30∶20∶1，V/V）混合提取液；0.03%（W/V）聚甲醛磷酸溶液；a-茄堿標準（krompotatosprouts），SIGMA，Chemistry Co U.S.A等。

1.1.3 供試菌種及準備。植物乳桿菌（Lactobacillus plantar-um），凍干安瓶原種ACCC11016購自中國農業微生物菌種保藏管理中心。原種經過前期的培養研究，進一步從中馴化培育出一株高產酸菌，擴繁后再次凍干保存備用。用前再次活化：將冷凍干燥的菌種按無菌操作要求從安瓿管中取出，放入5 mL液體MRS培養基中，于28 ℃在培養箱中復蘇48 h。取200 μL復蘇后的菌種懸液涂布于MRS固體平板進行二次復蘇，在培養箱中于28 ℃培養48 h后挑取單菌落進行劃線培養。

1.1.4 培養基的配制。試驗中使用的4種培養基分別為MRS液體培養基、MRS固體培養基、含馬鈴薯秧藤汁的液體培養基、含馬鈴薯秧藤顆粒的液體培養基。其中含馬鈴薯秧藤汁的液體培養基的配制：在MRS液體培養基的配方基礎上，分別添加馬鈴薯秧藤汁20、40、80、160、320 mL后定容至1 000 mL，制成1、2、3、4、5號共5個濃度梯度的培養基；含馬鈴薯秧藤顆粒的液體培養基：在MRS液體培養基的配方基礎上，添加馬鈴薯鮮秧藤切碎顆粒（2 mm≤？覫≤5 mm）100 g，后定容至1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌細胞計數法。培養液中的細菌數測定使用直接涂片計數法[10]。

1.2.2 糖苷生物堿含量測定方法。馬鈴薯鮮秧藤、秧藤汁液、發酵后秧藤碎顆粒、發酵后含秧藤汁培養基液中的生物堿（全稱1，6-糖苷生物堿totalsglyeoalka-olids，下稱TGA）含量的測定方法，采用周寶利[11]和霍權恭[12]的文獻中使用的分光光度法，原理是TGA和聚甲醛磷酸可發生特定的呈色反應。①標樣配制：吸取0.50 mL 0.8 g/L的a-茄堿標液于25 mL比色管中，準確加入4.00 mL聚甲醛磷酸顯色劑，室溫反應30 min，以試劑空白為參比，用1 cm比色皿，于620 nm波長處測定吸光度值。②試樣前處理：稱取馬鈴薯秧藤約50 g（或發酵后馬鈴薯秧藤碎顆粒約100 g、或發酵后含馬鈴薯藤汁培養液500 mL），加120 mL提取液，于高速組織搗碎機中搗碎10 imn并成漿狀，快速濾紙過濾（其中發酵液樣品需先作預想處理），濾液1 250 g離心5 min，準確量取上清液100 mL，加2 mL冰乙酸，超聲波振蕩5 min。氨水調節pH值至10.5，沸水浴濃縮至干，冷卻后，用少量pH值10.5的氨水洗滌殘留物2次，并以7 800倍重力離心，棄去清液。殘留物水浴蒸干，用3.00 mL 7%磷酸溶解，7 800倍重力再離心5 min，清液供測定糖苷生物堿使用。

1.2.3 試驗步驟。試驗步驟分為四步，分別為乳酸菌適應性能的馴化培養→馴化培養效果檢測試驗→對秧藤脫毒能力測定→培養液中生物堿含量的測定，具體如表1所示。

（1）菌種適應性馴化培養。將激活的植物乳桿菌在MRS固體培養基劃線培養，取菌落接種于1號“馬鈴薯秧藤汁液體培養基”中進行適應性馴化培養，48 h后轉接入2號，以此方法依次接入3、4、5號。經過連續5個培養期的馬鈴薯秧藤汁液濃度遞增的培養后，將所得菌種擴繁、冷凍干燥保存。

（2）馴化培養效果檢測。以未馴化菌作為對照，將馴化菌接入含有秧藤顆粒的液體培養基中，分別培養24、48、72 h后，過濾去除秧藤顆粒，測試培養基液體部分中的pH值和細菌細胞數。

（3）秧藤脫毒能力測定。對上述（1）中凍干的馴化菌和未馴化前的凍干菌進行同步活化。將2種細菌分別接入“馬鈴薯秧藤顆粒液體培養基”中，培養48 h后，過濾培養液，挑揀選取馬鈴薯秧藤顆粒。將挑揀出的馬鈴薯秧藤顆粒稱重，測試2種菌培養下馬鈴薯秧藤顆粒中糖苷生物堿的含量；同時測試未經過發酵的新鮮馬鈴薯秧藤顆粒作為共同的對照。

（4）浸出液中生物堿含量測定。對上述（1）中凍干的馴化菌和未馴化前的凍干菌進行同步活化。將2種細菌分別接入3組“馬鈴薯秧藤顆粒液體培養基”中，各自培養24、48、72 h后，終止培養，過濾培養液，去除薯秧藤顆粒，保留過濾的培養液。測試培養液中糖苷生物堿的含量。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的馴化培養結果

從表2可以看出，經過多代數馴化培養的乳酸菌，對含有秧藤汁培養基的適應性增強，繁殖數量多；而未經馴化的乳酸菌適應差，繁殖數量較少。該試驗尚不能確定乳酸菌的遺傳變異，但至少可以說明其對不同濃度秧藤汁有較強的適應性變化，應用在在馬鈴薯藤發酵生產實踐中可以提高成活率，加快發酵速度。endprint

2.2 對秧藤脫毒能力測定的結果

從表3可以看出，馴化菌的發酵過程對培養基中的馬鈴薯秧藤顆粒中的生物堿脫出能力起到增強的效果。馴化菌的繁殖能力強、產酸多，環境pH值下降快，生物堿溶出并隨汁液分流去除較多，秧藤中殘留較少。

2.3 培養液中生物堿含量的測定結果

從表4可以看出，馴化菌對培養基中的馬鈴薯秧生物堿降解能力強于未馴化菌；二者的培養液中早期均殘留有較高的生物堿，隨著時間的推移，含量逐漸減少。由此表明，乳酸菌發酵過程不僅能溶解出生物堿，而且對生物堿有降解作用[11-12]。

3 結論與討論

新鮮秧藤的生物堿含量在100～300 mg/kg·dm之間，與李克來的測試結果相近。若成年牛采食一次用鮮秧藤5 kg，食入的生物堿達1 g，可達到中毒量，所以新鮮秧藤必須經過處理才能作為飼料。利用植物乳酸菌發酵新鮮秧藤，可使得秧藤中的生物堿溶出，含量降低到100 mg/kg·dm的安全線以下，從而起到脫除毒性的作用。使用經過馴化的專用植物乳酸菌，有更強的溶出生物堿能力，含量降低到30 mg/kg·dm以下，達到對秧藤更好的脫毒效果。此外，利用這一馴化菌，發酵浸出液中保存有較多生物堿，含量達到20 mg/mL以上，但隨發酵持續時間，呈逐步降解趨勢。建議在發酵早期，從發酵浸出液中收集生物堿，用于進一步的提取利用。

4 參考文獻

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