超高效液相色譜—熒光法測定番石榴中多菌靈農藥殘留

李盛安+馮敏鈴

摘要 建立了超高效液相色譜（UPLC）對番石榴中多菌靈（MBC）殘留的分析方法。番石榴經乙腈提取后，MCX小柱凈化，熒光檢測器測定，外標法定量；對樣品前處理和色譜分離條件進行優化。通過比較QuEChERS法與加速溶劑萃取ASE 2種提取方式，對比NH2和MCX固相萃取柱凈化效果，確定番石榴中多菌靈的檢測方法。結果表明：多菌靈含量在0.01～0.50 μg/mL間呈良好的線性關系，相關系數r=0.999 9。添加0.05～1.00 μg/mL濃度，平均回收率在84.6%～93.5%，方法最低檢出限為0.004 mg/kg，方法定量限為0.020 mg/kg。方法具有前處理簡單、準確性高、經濟、分析速度快等特點，適合在番石榴大規模上市前集中批量快速檢測。

關鍵詞 多菌靈殘留；超高效液相色譜；熒光檢測器；MCX小柱；番石榴

中圖分類號 S481+.8 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）14-0116-02

番石榴營養豐富，VC含量極高，果實具有治療糖尿病及降低血糖的藥效，葉片也可以治療腹瀉。果實除了能鮮食外，還可加工成果汁、濃縮汁、果粉、果醬、濃縮漿、果凍等[1-2]。由于種植番石榴可獲得較好的經濟效益，其在珠江三角洲地區種植面積廣，已成為廣大農民發家致富的一條有效途徑。

多菌靈又名棉萎靈、苯并咪唑44號，化學名2-苯并咪唑基氨基甲酸甲酯，是一種廣譜性殺菌劑，廣泛應用于蔬菜、水果等多種病害的防治[3-6]。農戶常用多菌靈農藥來預防番石榴炭疽病，多菌靈農藥目前還未列入農業行政主管部門的例行監測項目，且大型農貿批發市場農殘快速檢測試劑盒只針對果蔬中有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測。因此，開發一種快速簡單檢測多菌靈農藥殘留的方法迫在眉睫。本試驗使用超高效液相色譜議UPLC進行檢測，采用了小內徑柱，柱效提高，有更好的分離效果，多菌靈保留時間為5.356 min。通過簡化樣品前處理過程、選擇合適的固相萃取小柱及流動相，以達到回收率高、檢出限低的要求，本方法具有簡單、重復性好的特點，且熒光檢測器響應值高，定性、定量準確，滿足批量樣品檢測的工作要求，可在番石榴大規模上市前應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑。多菌靈標樣（農業部環境保護科研監測所100 μg/mL）；乙腈、甲醇（德國merck色譜純）；鹽酸、無水硫酸鈉、氨水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水硫酸鎂、醋酸 （廣州化學試劑廠 GR）；癸烷磺酸鈉（阿拉丁GR）；磷酸、三乙胺（天津市科密歐 HPLC）；PSA（N-丙基乙二胺）、石墨炭黑（美國Agilent）；離子對試劑：吸取7.0 mL磷酸于200 mL水中，加入1.0 g癸烷磺酸鈉，超聲溶解，再加入10.0 mL三乙胺，稀釋到1 000 mL；磷酸鹽緩沖溶液（0.02 mol/L，pH值6.8）：1.38 g磷酸二氫鈉和1.41 g磷酸氫二鈉溶于900 mL水中，用磷酸調節pH值至6.8，定容至1 000 mL。

1.1.2 儀器與設備。電子天平（Precisa公司）；旋渦混合器（上海精科實業有限公司XW-80A）；振蕩搖床（IKA KS501）；pH計（Sartorius PP-20-P11）；氮吹儀（天津恒奧 HGC-24A）；離心機（Sigma公司3-30k）；Waters超高效液相色譜儀（帶熒光檢測器）；分散機（德國IKA T18）；加速溶劑萃取ASE（DIONEX ASE100）；超純水器（Millipore公司Mini-Q）；固相萃取柱：NH2小柱（Agilent 500 mg，6 mL）；MCX小柱（Waters 150 mg，6 mL）

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理。將番石榴四分法切碎后置于食品攪拌機中打漿，用塑料樣品瓶-18 ℃密封保存。

1.2.2 提取。準確稱取試樣25.00 g（精確至0.01 g）于100 mL具塞離心管中，放入陶瓷均質子（防止鹽結塊），加入約5 g無水硫酸鈉，再加入25 mL乙腈，蓋上蓋子，在搖床上振搖20 min后取出。以5 000 r/min的轉速離心5 min，使乙腈和水分層。吸取5 mL乙腈提取液在50 ℃氮吹儀吹至近干，備用。

1.2.3 凈化。往吹至近干的試管中加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸漩渦溶解殘渣2 min后，分2次待過柱。將MCX小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水進行預洗，待液面到達填料表面時，迅速加入提取液，再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗不收集。最后用3 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，重復1次，擠干，收集。50 ℃氮吹儀吹至近干后，用1.0 mL流動相溶解，過0.2 μm濾膜，待測。

1.2.4 標準溶液配制。取1支多菌靈標準品，全部轉移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。相當于濃度為10.00 μg/mL多菌靈標準儲備液，然后置于-18 ℃條件下保存，有效期為1個月。標準工作溶液，用流動相定容現配現用，相當于多菌靈濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL。

1.2.5 色譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 2.1×150 mm 3.5 μm；流動相：甲醇∶水（v/v）=6∶4；流速0.2 mL/min；檢測波長：熒光FLR激發波長286 nm、發射波長315 nm；進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 流動相選擇

本試驗分別考查了甲醇+癸烷磺酸鈉離子對試劑溶液（40+60）、乙腈+水（50+50）、甲醇+水（60+40）、乙腈+磷酸鹽緩沖溶液（80+20）作為流動相對多菌靈的分離效果。試驗結果表明，上述幾種流動相都能分離多菌靈，而考慮到對環境的影響因素和配制過程的復雜程度，選擇毒性相對較小、價格便宜且配制過程簡單的甲醇+水（60+40）作為流動相，多菌靈在番石榴基質中的超高效液相色譜圖如圖1所示。endprint

2.2 固相萃取柱的選擇

分別選取6 mL的NH2小柱與MCX小柱做加標回收試驗，將NH2與MCX小柱進行對比，同時每種小柱做3個平行，選擇平均回收率高的作為凈化柱，NH2小柱凈化方法如下：按上述1.2.2步驟后，往吹至近干的試管加入2 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）漩渦溶解殘渣2 min后，待過柱。將NH2小柱用3 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）進行預洗，當溶劑液面到達柱子吸附層表面時，迅速加入提取液，再用3 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）淋洗，重復1次，擠干，收集。在用50 ℃氮吹儀吹至近干后，用1.0 mL甲醇溶解，過0.2 μm濾膜，待測。

結果表明：NH2小柱平均回收率接近65%，MCX小柱平均回收率則接近90%，因此，選擇MCX小柱作為凈化小柱。

2.3 樣品前處理的選擇

本試驗前處理方法與加速溶劑萃取ASE進行加標回收提取效率比較，提取液氮吹近干后，按上述1.2.3步驟操作。結果表明：本試驗方法與加速溶劑萃取ASE回收率都大于80%，皆可以作為多菌靈的提取方法。但考慮到加速溶劑萃取ASE操作復雜、萃取池少、需要定時更換儀器消耗品等特點，難以滿足快速批量檢測的需要。最后選擇乙腈振蕩提取，適合樣品量大，能快速篩查，滿足了批量檢測的工作要求。

2.4 固相萃取與QuEChERS的比較

QuEChERS是一種簡單快速的樣品提取和凈化方法，多用于水果蔬菜中的多農藥殘留檢測[7-12]。對比試驗設計如下：稱5 g加標質控樣品于50 mL試管中，依次加入5 g無水硫酸鈉、1.5 mL醋酸、20 mL乙腈，振蕩搖床上振搖20 min取出，5 000 r/min離心5 min。取出乙腈提取液10 mL加入1 000 mg無水硫酸鈉、300 mg PSA（N-丙基乙二胺）、50 mg石墨炭黑旋渦混合5 min，5 000 r/min離心3 min。上清液過0.2 μm濾膜，待測。結果表明，經QuEChERS方法前處理后供色譜上機分析時，干擾物質較多，樣品分析基線分離不理想，目標峰難以積分，不能準確地定性、定量，容易出現假陽性。QuEChERS方法前處理簡單，凈化后多供GC/MS或LC/MS分析[9-15]。由于質譜分析法是對樣品離子質荷比（m/z）的測定來進行分析的一種分析方法，定性的準確度要高于色譜分析。但由于GC/MS與LC/MS價格昂貴、操作復雜、維護成本高等特點不容易普及，因此本試驗超高效液相色譜法不采用QuEChERS方法做前處理方法。

2.5 方法標準曲線、檢出限及定量限

用不含多菌靈的番石榴空白溶液作基質，以峰面積為縱坐標，以標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。求得線性方程y=2 941 333x-19 929.5，相關系數r=0.999 9。按本方法測定的結果，以3倍信噪比確定多菌靈分析物的檢出限（S/N=3）為0.004 mg/kg，10倍信噪比定量限（S/N=10）為0.020 mg/kg。

2.6 回收率與精密度

以不含多菌靈的番石榴溶液作空白基質添加一定量的多菌靈標準品做添加回收試驗，每個添加濃度重復測定6次，同時做空白試驗。如表所示，添加平均回收率在84.6%～93.5%，相對標準偏差（RSD）為2.74%～3.15%（表1）。說明該方法具有較好的回收率和精密度，可以滿足相關檢測要求。

3 結論與討論

通過優化提取溶劑、樣品凈化等前處理方法建立了超高效液相色譜法測定番石榴中多菌靈農藥殘留的方法。本方法采用超高效液相色譜達到了節約試劑，減少有機試劑對環境污染的目的，具有樣品前處理操作簡單、準確性高和快速等特點，較高的靈敏度和精密度滿足實際樣品檢測的需要，適用于番石榴樣品中多菌靈殘留快速、批量檢測的工作要求，在實際檢測過程中可以將其作為常規殘留檢測方法使用。

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