兔椎間失穩(wěn)彈性內(nèi)固定后軟骨終板蛋白多糖含量變化的實驗研究

張昭　楊學(xué)軍　宋雄英等

[摘要] 目的 探討椎間失穩(wěn)環(huán)境下軟骨終板蛋白多糖的變化。 方法 選取48只6月齡日本大耳白兔，體重（2.50±0.15）kg，均在相同環(huán)境條件下喂養(yǎng)，隨機分為對照組和實驗組，每組各24只；兩組兔均進行椎間手術(shù)失穩(wěn)。實驗組在手術(shù)失穩(wěn)2個月后用椎弓根螺絲釘和張力鋼絲彈性內(nèi)固定的方法進行L6/7的穩(wěn)定性重建，對照組不進行穩(wěn)定性重建。兩組分別在內(nèi)固定術(shù)后2、4、6個月取材對椎間盤軟骨終板蛋白多糖進行檢測，比較不同時間軟骨終板蛋白多糖水平變化。 結(jié)果 ①組內(nèi)比較，兩組術(shù)后2、4、6個月蛋白多糖灰度及光密度值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。對照組術(shù)后4個月蛋白多糖灰度低于同組術(shù)后2個月，光密度值高于術(shù)后2個月，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；對照組術(shù)后6個月蛋白多糖灰度低于同組術(shù)后4個月，光密度值高于術(shù)后4個月，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。實驗組術(shù)后4個月蛋白多糖灰度高于同組術(shù)后2個月，光密度值低于術(shù)后2個月，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；實驗組術(shù)后6個月蛋白多糖灰度高于同組術(shù)后4個月，光密度值低于術(shù)后4個月，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。②組間比較，實驗組術(shù)后6個月蛋白多糖灰度高于對照組，光密度值低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 彈性內(nèi)固定能有效地阻止椎間盤軟骨終板蛋白多糖的退變，而且有部分恢復(fù)的征象，它為進一步進行其他治療創(chuàng)造了必要條件。

[關(guān)鍵詞] 兔椎間盤；軟骨終板；蛋白多糖；彈性內(nèi)固定

[中圖分類號] R681.53 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）08（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the change of cartilage endplate protein polysaccharide in the condition of intervertebral instability. Methods 48 white macrotia rabbits of 6 months old with （2.50±0.15） kg weight were fed in the same environment and randomly divided into the control group and the experiment group， with 24 rabbits in each group. Rabbits in the two groups were all given intervertebral instability surgery. Rabbits in experiment group were reconstructed the L6/7 stability with pedicle screw and tension wire elastic internal fixation 2 months after the intervertebral instability surgery. Rabbits in control group were not reconstructed the L6/7 stability. The intervertebral disc cartilage endplate protein polysaccharide were detected in the two groups 2， 4， 6 months after the internal fixationi； the cartilage endplate proteoglycan level among different time were compared. Results ①The differences of protein polysaccharide grayscale and optical density value in the two groups 2， 4， 6 months after the fixation operation by variance analysis were statistically significant （P < 0.05）. The protein polysaccharide grayscale 4 months after fixation operation in control group were lower than those 2 months after fixation operation in the same term， the optical density values 4 months after fixation operation in control group were higher than those 2 months after fixation operation in the same term， the differences were statistically significant （P < 0.01）； the protein polysaccharide grayscale 6 months after fixation operation in control group were lower than those 4 months after fixation operation in the same term， the optical density values 6 months after fixation operation in control group were higher than those 4 months after fixation operation in the same term， the differences were statistically significant （P < 0.01）. The protein polysaccharide grayscale 4 months after fixation operation in experiment group were higher than those 2 months after fixation operation in the same term， the optical density values 4 months after fixation operation in experiment group were lower than those 2 months after fixation operation in the same term， the differences were statistically significant （P < 0.01）； the protein polysaccharide grayscale 6 months after fixation operation in experiment group were higher than those 4 months after fixation operation in the same term， the optical density values 6 months after fixation operation in experiment group were lower than those 4 months after fixation operation in the same term， the differences were statistically significant （P < 0.01）. ②The protein polysaccharide grayscale 6 months after fixation operation in experiment group were higher than those in control group， the optical density values 6 months after fixation operation in experiment group was lower than those in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The dynamic internal fixation can effectively prevent the degeneration of the proteoglycan cartilage endplate and partly recover from the degeneration. It can create the necessary condition for the other treatment.

[Key words] Rabbit intervertebral disc； Proteoglycan； Cartilage endplate； Dynamic internal fixation

椎間盤軟骨終板的退變過程是受各種因素影響變化的，這些因素包括生物自身擁有的內(nèi)部因素和生物體所處各種外部環(huán)境因素，因此每個生物體在不同環(huán)境、不同時間段軟骨終板的退變過程是不同的[1-2]。首先，傳統(tǒng)的椎間失穩(wěn)椎體間的融合內(nèi)固定后椎間軟骨終板仍是退變的[3-4]，而且其軟骨終板也沒有修復(fù)或恢復(fù)；其次，傳統(tǒng)的脊柱融合內(nèi)固定術(shù)后會出現(xiàn)臨近節(jié)段椎間盤退變加重的問題[5-7]，同時也有融合節(jié)段椎間活動功能喪失的問題；另外，關(guān)節(jié)失穩(wěn)后的穩(wěn)定性重建可有效阻止關(guān)節(jié)軟骨的退變，而且術(shù)后關(guān)節(jié)疼痛等癥狀明顯緩解。近年來，隨椎間失穩(wěn)后各種椎體間的彈性內(nèi)固定術(shù)的開展，逐步認(rèn)識到：椎間彈性內(nèi)固定可有效治療由椎間失穩(wěn)引起的腰腿痛，也可有效緩解臨近節(jié)段椎間盤的退變，并能適度保留椎體間的活動功能。本研究通過手術(shù)咬除兔L6椎體的兩側(cè)下關(guān)節(jié)突，單一改變腰椎內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成椎間失穩(wěn)，其后用張力鋼絲彈性內(nèi)固定的方法進行椎間穩(wěn)定性重建，研究張力鋼絲彈性內(nèi)固定對軟骨終板蛋白多糖退變的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

取48只6月齡日本大耳白兔[內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（蒙）2004-0023]，雌雄不限，體重（2.50±0.15）kg，均在相同環(huán)境下喂養(yǎng)，隨機分為對照組和實驗組，每組各24只。

1.2 手術(shù)方法

將兩組實驗兔行手術(shù)椎間失穩(wěn)造模，具體手術(shù)方法：將其腰背部皮毛刮除至清潔，用安定注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：0502043）1.25 mg/kg、氯胺酮（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號KH050305）0.02 g/kg、阿托品（天津金耀氨基酸有限公司，批號：0503151）0.125 mg/kg順次耳緣靜脈注射麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺上，用1%碘伏消毒手術(shù)區(qū)域；術(shù)者穿一次性無菌手術(shù)衣、戴無菌手套、鋪無菌手術(shù)巾，取雙側(cè)平對髂脊椎間隙（即L6/7）為中心，從正中做一長約5 cm縱行切口，切開皮膚及皮下組織，分離暴露棘突、椎板及上下關(guān)節(jié)突，然后依次切除L6/7棘上及棘間韌帶，咬除L6椎體下位全部小關(guān)節(jié)突，造成椎間失穩(wěn)，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗手術(shù)切口3次，依次縫合各層組織；術(shù)后各兔在單一籠中自由活動。2個月后將實驗組24只兔用椎弓根螺絲釘及張力鋼絲彈性內(nèi)固定法進行L6/7的穩(wěn)定性重建，術(shù)后兔仍在單一籠中自由活動；對照組不進行穩(wěn)定性重建。

1.3 軟骨終板蛋白多糖水平檢測

兩組兔均在實驗組術(shù)后2、4、6個月取椎間盤軟骨終板，采用過碘酸-Schiff（PAS）反應(yīng)法檢測其中蛋白多糖水平。

1.3.1 試劑 ①DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號：DAB-0031/1031）、APES防脫片劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號：GLU-0048）、UltrasensitiveTMSP超敏試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號：Kit-9710/9720/9730）；②偏重亞硫酸鈉（上海試劑四廠，批號：700710）；③堿性品紅（HG2-313-80）（天津市勝利化工廠，批號：060114）；④乙二胺四乙酸（EDTA）[汕頭市金砂企業(yè)（集團）金砂化工廠，分析純]；⑤Schiff液的配制：堿性品紅5 g加入煮沸的蒸餾水100 mL，振蕩5 min，冷卻至50℃過濾，加入1 mol/L鹽酸10 mL，冷卻至25℃時加偏重亞硫酸鈉3 g并遮光放置24 h后加入活性炭（吸色）1 g，振蕩1 min后過濾，將濾液遮光保存在0～4℃處備用。

1.3.2 設(shè)備 ①徠卡RM系列C14662光鏡樣品切片機（德國）；②LKB-UltrotomeⅤ型超薄切片機（瑞典）；③JD801圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達科技有限公司）；④BG-9000 C形臂X線機，手提式X線透視儀BJI-1X型（德國）；⑤手術(shù)器械：指骨用螺釘100只（直徑2 mm、長10 mm）、醫(yī)用鋼絲300 cm（直徑0.9 mm）；⑥HR-7751-M型微波爐（山東青島海爾公司）。

1.3.3 取材 將實驗兔耳緣靜脈注射25 mL空氣栓塞處死，用骨刀快速切取完整L6/7椎間盤并保留部分軟骨終板下松質(zhì)骨，先取橫截面為2 mm×2 mm左右包含軟骨終板并包含部分軟骨終板下松質(zhì)骨的組織放入3%戊二醛固定液中固定，余組織放入中性甲醛溶液中固定，24 h后用15%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液脫鈣[8-10]。

1.3.4 脫鈣 將所取的軟骨終板組織放入裝有15%EDTA溶液的安瓿中，軟骨終板組織用硫酸紙標(biāo)記，安瓿用瓶蓋封閉放入約盛1200 mL 17℃自來水的塑料盆中，在微波爐中用中低兩檔加熱12 min，然后換1200 mL 17℃自來水繼續(xù)在微波爐中用中低兩檔加熱12 min，自來水用來控制軟骨終板組織脫鈣時的溫度始終在50℃以下，如此每日反復(fù)2 h后換15%EDTA溶液，放入37℃溫箱中過夜，第2天再換1次15% EDTA溶液進行微波脫鈣，標(biāo)本可用8 d左右完成脫鈣，完整椎間盤可用16 d左右完成脫鈣[11-12]。

1.3.5 制片 載玻片清潔后用3-氨丙基-3-甲氧基硅烷（APES）防脫片劑（丙酮50倍稀釋）常規(guī)處理，蓋玻片常規(guī)清潔處理；脫鈣后將組織用自來水沖洗12 h→5%無水硫酸鈉飽和溶液浸泡8 h→自來水沖洗12 h→（脫水）50%乙醇12 h→（脫水）70%乙醇12 h→（脫水）80%乙醇8 h→（脫水）95%乙醇（Ⅰ）3 h→（脫水）95%乙醇（Ⅱ）3 h→（脫水）100%乙醇（Ⅰ）2 h→（脫水）100%乙醇（Ⅱ）2 h→（透明）二甲苯15 min→（滲蠟）48～50℃軟蠟10 min→（滲蠟）54～56℃軟蠟30 min→（滲蠟）56～58℃軟蠟50 min→石蠟包埋→修塊→切片[13-15]。

1.3.6 軟骨終板蛋白多糖的變化 蛋白多糖的檢測采用PAS反應(yīng)法。60℃烤片30 min→（脫蠟）二甲苯（Ⅰ）10 min→（脫蠟）二甲苯（Ⅱ）10 min→（脫苯）100%乙醇（Ⅰ）10 min→（脫苯）100%乙醇（Ⅱ）10 min→（水化）95%乙醇（Ⅰ）10 min→（水化）95%乙醇（Ⅱ）5 min→（水化）80%乙醇（Ⅰ）5 min→（水化）80%乙醇（Ⅱ）5 min→蒸餾水10 min→1%過碘酸液氧化10 min→自來水充分洗3 min蒸餾水過洗→加入Schiff液15 min（遮光）→自來水流水沖洗15 min，顯色（紅色）→蘇木精復(fù)染5 min→自來水流水沖洗8 min→（分化）1%鹽酸2 s→（返藍）水沖洗25 min→（脫水）80%乙醇一涮→（脫水）95%乙醇（Ⅰ）10 min→（脫水）95%乙醇（Ⅱ）10 min→（脫水）100%乙醇（Ⅰ）10 min→（脫水）100%乙醇（Ⅱ）10 min→（二甲苯透明）二甲苯（Ⅰ）10 min→二甲苯（Ⅱ）10 min→封片[16-18]。采用JD801圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，比較灰度及光密度值，通過對照片的灰度進行分析來測量樣品的光密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

組內(nèi)比較，對照組術(shù)后4個月蛋白多糖灰度低于同組術(shù)后2個月，光密度值高于術(shù)后2個月，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；對照組術(shù)后6個月蛋白多糖灰度低于同組術(shù)后4個月，光密度值高于術(shù)后4個月，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。實驗組術(shù)后4個月蛋白多糖灰度高于同組術(shù)后2個月，光密度值低于術(shù)后2個月，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；術(shù)后6個月蛋白多糖灰度高于同組術(shù)后4個月，光密度值低于術(shù)后4個月，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。組間比較，實驗組術(shù)后6個月蛋白多糖灰度高于對照組，光密度值低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1、圖1（封三）。

3 討論

近年來，臨床在處理椎間盤組織退變方面應(yīng)用了許多分子生物學(xué)和基因技術(shù)[19-21]，但出現(xiàn)的問題仍然是經(jīng)各種治療后，患者僅在一段時間內(nèi)或某些特定環(huán)境條件下有效，遠期效果方面始終不能達到預(yù)期。頸肩痛、腰腿痛大都是由于脊柱長期的退變形成椎間失穩(wěn)所導(dǎo)致[22-24]。因此，傳統(tǒng)頸肩痛、腰腿痛均采用神經(jīng)減壓椎間盤摘除椎間融合術(shù)治療，給患者帶來脊柱活動受限及以后臨近節(jié)段椎間盤退變加重等并發(fā)癥。近期使用的脊柱彈性內(nèi)固定系統(tǒng)（Bioflex、Dynesis K-ROD、Coflex等）已取得了一定的臨床療效，但也存在不足；為能從根本上解決目前各種治療的短效問題，本研究采用張力鋼絲彈性內(nèi)固定重建椎間穩(wěn)定的方法來阻止椎間失穩(wěn)后軟骨終板的退變。

本研究顯示，張力鋼絲彈性內(nèi)固定椎間失穩(wěn)后穩(wěn)定性重建，在術(shù)后2、4、6個月短期內(nèi)，實驗組軟骨終板蛋白多糖灰度逐漸升高，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；軟骨終板蛋白多糖光密度逐漸下降，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；組間比較，實驗組術(shù)后6個月蛋白多糖灰度高于對照組，光密度值低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），這與近期相關(guān)的研究數(shù)據(jù)相符[25-26]。由此推理手術(shù)張力鋼絲彈性內(nèi)固定進行失穩(wěn)后椎間穩(wěn)定性重建可使軟骨終板蛋白多糖的含量明顯增加[27]；這也說明張力鋼絲彈性內(nèi)固定術(shù)能有效阻止軟骨終板的退變和部分恢復(fù)軟骨終板結(jié)構(gòu)，從而提示在椎間失穩(wěn)的早期盡快恢復(fù)椎間盤的生物力學(xué)結(jié)構(gòu)[28-30]，可為椎間盤的修復(fù)創(chuàng)造良好的環(huán)境，也為其他各項治療提供良好的前提條件。為此可推理，在椎間失穩(wěn)的狀態(tài)下進行各種因子和各種基因技術(shù)的治療都是效果欠佳的，因為在失穩(wěn)狀態(tài)下椎間盤內(nèi)生物化學(xué)環(huán)境相對來說是惡劣的，因此植入的各種因子和基因載體所發(fā)揮的作用有限[31-33]。相關(guān)學(xué)者在各自的臨床實踐中得出相關(guān)結(jié)論顯示，如因椎間失穩(wěn)造成的頸肩痛及腰腿痛，在進行其他治療前則首先考慮進行椎間的生物力學(xué)穩(wěn)定性重建，使其更接近正常椎間結(jié)構(gòu)的生物力學(xué)狀態(tài)，以充分發(fā)揮其他治療的效果[34-35]。至于手術(shù)彈性內(nèi)固定治療時效性有待于以后進一步的臨床和動物的相關(guān)實驗研究論證[36]。

綜上所述，張力鋼絲彈性內(nèi)固定進行失穩(wěn)后的椎間穩(wěn)定性重建能有效阻止椎間軟骨終板蛋白多糖的退變，并能使退變的軟骨終板蛋白多糖得到部分的恢復(fù)。

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（收稿日期：2015-05-10 本文編輯：程 銘）