5種大黃制劑微生物限度檢查法的建立

李 思 方 李 吳晶晶 陸 崟 蘇 華 王曙東

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇南京 210002

《中國(guó)藥典》（2010年版）[1]強(qiáng)調(diào)對(duì)藥品的微生物限度檢查法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科（以下簡(jiǎn)稱“我科”）制劑以中藥為主，多種中藥材和中藥單體化合物有不同程度的抑菌性，本研究以大黃制劑為例，目的是建立對(duì)抑菌性較強(qiáng)中成藥的微生物限度檢查方法，驗(yàn)證過(guò)程中當(dāng)采用常規(guī)法不能真實(shí)反映制劑微生物污染情況時(shí)，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法或薄膜過(guò)濾法等方法先消除供試品中的抑菌活性，再進(jìn)行微生物限度檢查，以有效控制制劑質(zhì)量。微生物限度檢查是控制制劑質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，制劑質(zhì)量控制是制劑生產(chǎn)銷(xiāo)售的關(guān)鍵，所以針對(duì)不同類型制劑建立安全有效的微生物限度檢查法對(duì)控制我科制劑的安全性有著至關(guān)重要的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PYX-DHS-40×50型隔水式電熱恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；ML160型霉菌培養(yǎng)箱 （上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 樣品

選取我科自制制劑保腎片、新保腎片、腎炎寧片、新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊，每種制劑選取近期的3個(gè)批次作為驗(yàn)證樣品。

保腎片（批號(hào):141230、150126、150202），新保腎片（批號(hào):141227、150114、150128），腎炎寧片（批號(hào):141223、150118、150210），新腎炎膠囊（批號(hào):141230、150116、150204），炎黃保腎膠囊（批號(hào):150112、150126、150209）均由我科提供。

1.3 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌[編號(hào) CMCC（B）26003第 3代]，枯草芽孢桿菌[編號(hào) CMCC（B）63501第 4代]，大腸埃希菌[編號(hào) CMCC（B）44102 第 4 代]，白色念珠菌[編號(hào)CMCC（F）98001 第 3 代]，黑曲霉[編號(hào) CMCC（F）98003第3代]均由江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.4 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制，批號(hào):130513），玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制，批號(hào):141010），營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制，批號(hào):130311），膽鹽乳糖培養(yǎng)基（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制，批號(hào):140212），MUG培養(yǎng)基（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制，批號(hào):130307），改良馬丁培養(yǎng)基（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制，批號(hào):130830），改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制，批號(hào):130923）均由江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所提供。按規(guī)定進(jìn)行的適用性檢查結(jié)果合格。稀釋劑為pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗劑為0.1%蛋白胨（規(guī)格:250 g，北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制，批號(hào):130814）。

2 方法與結(jié)果

按《中國(guó)藥典》（2010年版）[1]一部附錄微生物限度檢查法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.1 菌液制備[2]

2.1.1 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌

用陽(yáng)性菌專用接種環(huán)取適量金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物置已滅菌的10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，將接種這3株菌的培養(yǎng)基置于細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）中培養(yǎng) 18～24 h，分別取各培養(yǎng)物1 mL加至0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9 mL中，金黃色葡萄球菌10倍遞增稀釋至1/106，大腸埃希菌10倍遞增稀釋至1/10-7，枯草芽孢桿菌10倍遞增稀釋至1/105，分別制成每毫升含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.2 白色念珠菌

用陽(yáng)性菌專用接種環(huán)取適量白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物置已滅菌的10 mL改良馬丁培養(yǎng)基中，將接種好的培養(yǎng)基置于霉菌培養(yǎng)箱（23～28℃）中培養(yǎng)36～48 h，取培養(yǎng)物1 mL加至0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9 mL中，10倍遞增稀釋至1/105，制成每毫升含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.3 黑曲霉

用陽(yáng)性菌專用接種環(huán)取適量黑曲霉新鮮培養(yǎng)物置于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，將接種好的培養(yǎng)基置于霉菌培養(yǎng)箱（23～28℃）中培養(yǎng)7 d，形成大量孢子，洗脫孢子過(guò)濾，取1 mL孢子液，制成孢子懸液，使之每毫升含孢子數(shù)為50～100 cfu。

2.2 供試液制備

取供試品（5種制劑每種各3個(gè)批次）10 g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀研勻，制成1∶10均勻混懸液作為供試液備用。

2.3 回收率測(cè)定

細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查方法的建立:若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，可按該供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)；若任一次平行試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)建立新的方法，并重新驗(yàn)證。

2.3.1 常規(guī)法[3]

2.3.1.1 試驗(yàn)組 分別取上述5種制劑各3個(gè)批號(hào)的供試液（1∶10）1 mL，注入 10 個(gè)平皿中，2 個(gè)一組分為5組，每組分別加入上述稀釋的5種菌懸液1 mL（50～100 cfu），每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，細(xì)菌傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置霉菌培養(yǎng)箱（23～28℃）培養(yǎng) 72 h。

2.3.1.2 菌液組 取10個(gè)平皿，2個(gè)一組分成5組，分別取上述稀釋的5種菌懸液1 mL注入每組平皿中，每個(gè)菌平行制備2個(gè)平皿，細(xì)菌傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置霉菌培養(yǎng)箱（23～28℃）培養(yǎng)72 h，測(cè)定所加入的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.1.3 供試品對(duì)照組 每種培養(yǎng)基制備2個(gè)平皿，分別取上述5種制劑各3個(gè)批號(hào)的供試液 （1∶10）1 mL分別注入，傾注培養(yǎng)基，待凝固后，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置霉菌培養(yǎng)箱（23～28℃）培養(yǎng)72 h，以測(cè)定供試品的本底菌數(shù)。

2.3.1.4 稀釋劑對(duì)照組 本品未用特殊方法處理和制備，所以未設(shè)置該組。

2.3.1.5 驗(yàn)證結(jié)果 依照下列公式，計(jì)算常規(guī)法項(xiàng)下5種大黃制劑的試驗(yàn)菌回收率:

由表1可知，5種大黃制劑對(duì)枯草芽孢桿菌均有很強(qiáng)的抑菌作用，均需改用培養(yǎng)基稀釋法或薄膜過(guò)濾法重新驗(yàn)證；新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑菌作用；腎炎寧片、新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊對(duì)白色念珠菌有一定的抑菌作用；保腎片和新保腎片對(duì)白色念珠菌及黑曲霉均無(wú)抑制作用，回收率均達(dá)到70%以上，故可采用常規(guī)法測(cè)定這2個(gè)品種的霉菌和酵母菌數(shù)。

表1 常規(guī)法項(xiàng)下5種大黃制劑的試驗(yàn)菌回收率（%）

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法[4-5]

2.3.2.1 試驗(yàn)組 分別取上述5種制劑各3個(gè)批號(hào)的供試液（1∶10）0.2 mL 置于 10個(gè)平皿，2個(gè)一組分成5組，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，即供試液每平皿0.2 mL，依次加入上述稀釋的5種菌懸液1 mL（50～100 cfu），細(xì)菌傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置霉菌培養(yǎng)箱（23～28℃）培養(yǎng)72 h。

2.3.2.2 菌液組 取10個(gè)平皿，2個(gè)一組分成5組，每個(gè)菌平行制備2個(gè)平皿，分別取上述稀釋的5種菌懸液1 mL注入每組平皿中，細(xì)菌傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置霉菌培養(yǎng)箱（23～28℃）培養(yǎng)72 h，測(cè)定所加入的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.2.3 供試品對(duì)照組 分別取上述5種制劑各3個(gè)批號(hào)的供試液0.2 mL置4個(gè)平皿中，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基每種培養(yǎng)基制備2個(gè)平皿，即供試液每平皿0.2 mL，待凝固后，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置霉菌培養(yǎng)箱（23～28℃）培養(yǎng)72 h，以測(cè)定供試品的本底菌數(shù)。

2.3.2.4 稀釋劑對(duì)照組 本品未用特殊方法處理和制備，所以未設(shè)置該組。

2.3.2.5 驗(yàn)證結(jié)果 依照下列公式，計(jì)算培養(yǎng)基稀釋法項(xiàng)下5種大黃制劑的試驗(yàn)菌回收率:

由表2可知，經(jīng)培養(yǎng)基稀釋（每平皿0.2 mL），保腎片、新保腎片和腎炎寧片3個(gè)品種對(duì)5株試驗(yàn)菌的回收率均高于70%，證明無(wú)抑菌作用。新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌作用較強(qiáng)，采用培養(yǎng)基稀釋法不能完全消除其抑菌作用，需改用薄膜過(guò)濾法重新驗(yàn)證；對(duì)白色念珠菌和黑曲霉已無(wú)抑制作用，回收率均70%以上，可采用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定。

2.3.3 薄膜過(guò)濾法[6]

2.3.3.1 試驗(yàn)組 分別取上述新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊各3個(gè)批次的供試液（1∶10）1 mL，加入裝有100 mL沖洗液的過(guò)濾器中，經(jīng)減壓抽濾，每次約100 mL沖洗，共沖洗300 mL/膜，在最后一次沖洗液中依次加入上述稀釋的細(xì)菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的菌懸液 1 mL（50～100 cfu），抽濾干凈后取膜，菌面向上貼于凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng) 48 h。

表2 培養(yǎng)基稀釋法項(xiàng)下5種大黃制劑的試驗(yàn)菌回收率（0.2 mL/皿，%）

2.3.3.2 菌液組 分別取上述稀釋的細(xì)菌菌液（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）1 mL，加入裝有100 mL沖洗液的過(guò)濾器中，經(jīng)減壓抽濾，每次約100 mL沖洗，共沖洗300 mL/膜，抽濾干凈后取膜，菌面向上貼于凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng) 48 h。

2.3.3.3 供試品對(duì)照組 分別取上述新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊各3個(gè)批次的供試液（1∶10）1 mL，加入裝有100 mL沖洗液的過(guò)濾器中，經(jīng)減壓抽濾，每次約100 mL沖洗，共沖洗300 mL/膜，抽濾干凈后取膜，菌面向上貼于凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置細(xì)菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng) 48 h。

2.3.3.4 稀釋劑對(duì)照組 本品未用特殊方法處理和制備，所以未設(shè)置該組。

2.3.3.5 驗(yàn)證結(jié)果 依照下列公式，計(jì)算薄膜過(guò)濾法項(xiàng)下2種大黃制劑的試驗(yàn)菌回收率:

由表3可知，經(jīng)薄膜過(guò)濾后，新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%，證明已無(wú)抑菌作用，可采用薄膜過(guò)濾法對(duì)這2個(gè)品種進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查。

2.4 控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證

2.4.1 試驗(yàn)組

分別取上述5種制劑的供試液（1∶10）10 mL及92 cfu的大腸埃希菌，加入100 mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，置 30～35℃培養(yǎng)箱 18～24 h，取上述培養(yǎng)物0.2 mL接種至含5 mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5、24 h在366 nm紫外燈下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。

表3 薄膜過(guò)濾法項(xiàng)下2種大黃制劑的試驗(yàn)菌回收率（%）

2.4.2 陰性菌對(duì)照組

分別取上述5種制劑的供試液（1∶10）10 mL及93 cfu的金黃色葡萄球菌，加入100 mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，置 30～35℃培養(yǎng)箱18～24 h，取上述培養(yǎng)物0.2 mL接種至含5 mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5、24 h在366 nm紫外燈下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。

2.4.3 驗(yàn)證結(jié)果

由表4可見(jiàn)，采用常規(guī)法，控制菌（大腸埃希菌）能正常檢出，陰性對(duì)照未檢出金黃色葡萄球菌，符合《中國(guó)藥典》（2010年版）微生物限度檢查驗(yàn)證要求，所以常規(guī)法可用于這5種大黃制劑的控制菌檢查。

表4 控制菌（大腸埃希菌）驗(yàn)證結(jié)果

2.5 微生物限度檢查法建立

根據(jù)以上試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，建立5種大黃制劑的微生物限度檢查法，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 5種大黃制劑微生物限度檢查法

3 討論

我國(guó)具有大量寶貴的中藥資源，而中草藥在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷與細(xì)菌抗?fàn)帲饾u成為天然的抑菌藥物[7]，中成藥中含有較強(qiáng)抑菌成分時(shí)，要先排除抑菌成分的干擾[8]，才能真實(shí)反映制劑污染微生物的狀況，有研究報(bào)道過(guò)大黃與其他多種藥材的抑菌性[9]，大黃的抑菌作用相對(duì)都較強(qiáng)[10-11]，所以建立大黃制劑微生物限度檢查法時(shí)，必須先消除其抗菌性，才能正確反映制劑的微生物污染情況。

本研究選取的5種制劑均以大黃藥材提取物為主要成分，大黃主要含蒽醌類化合物，主要包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等，為大黃發(fā)揮抗菌作用的主要成分[12]，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌等均有較強(qiáng)的抑制作用，5種制劑中保腎片、新保腎片和腎炎寧片含量測(cè)定以大黃酸、大黃素和大黃酚為主[13-14]，新腎炎膠囊含量測(cè)定以大黃素為主，炎黃保腎膠囊含量測(cè)定以大黃酸為主。試驗(yàn)結(jié)果表明，5種大黃制劑中所含大黃蒽醌類成分含量不同，發(fā)揮抑菌作用效果也不同，含量愈高，抑菌作用也愈強(qiáng)。在對(duì)同一種中藥原料制劑進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，由于所含主要成分差異以及含量高低而導(dǎo)致抑菌作用不同，故排除抑菌干擾所采取的方法也不同，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立準(zhǔn)確合適的微生物限度檢查方法以保證制劑質(zhì)量。

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