胰腺癌細胞DPYD、MTHFR基因單核苷酸多態性分析

張孝平，張文靜，陳寶安* ，柏志斌，馮繼峰，程 璐

(1東南大學醫學院附屬中大醫院，南京210009;2東南大學醫學院腫瘤系;3江蘇省腫瘤研究所;4東南大學生物科學與醫學工程學院生物電子學國家重點實驗室)

胰腺癌(PC)臨床發病隱匿，發展迅速，預后極差。據統計，2009年美國新增PC患者42 470例，83%的患者在1年內死亡［1］。目前，手術切除是PC唯一可治愈性方法，但85%的患者就診時已屬晚期或發生遠處轉移，手術切除率為10% ～15%。因此，化療在PC綜合治療中占有重要地位。近年來，盡管PC的一線化療方案多以吉西他濱為基礎，但氟尿嘧啶類藥物5-FU、卡培他濱等仍是PC化療中最常用藥物。二氫嘧啶脫氫酶(DPD)及亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是氟尿嘧啶類藥物體內代謝的關鍵酶，為探討PC細胞株中二氫嘧啶脫氫酶(DPYD)基因、MTHFR基因的單核苷酸多態性(SNPs)位點基因型，2010年12月～2011年8月，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 新生小牛血清(杭州四季青公司)，RPMI-1640液(美國 Gibco公司)，0．25%胰酶(Sigma公司)，DNA 提取試劑盒、dNTP、Taq DNA 酶(德國Qiagen公司)。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養及基因組DNA提取 PC細胞株SW1990、PANC-1、CFPAC由東南大學醫學院實驗室傳代培養。將細胞接種于10%小牛血清RPMI-1640培養液，置37℃、5%CO2、95%濕度培養箱中培養，貼壁細胞用0．25%胰蛋白酶消化傳代。采用德國Qiagen公司產試劑盒提取基因組DNA。

1．2．2 PCR擴增及產物純化 采用Assay Designer軟件設計PCR引物，PCR引物由上海邃志公司合成，PCR引物序列(略)。PCR反應體系中含有5 ng模板 DNA 的 1 μl、水 0．95 μl、PCR 緩沖液 0．625 μl、2．5 mmol/L 的 dNTP 1 μl、25 mmol/L 的 MgCl20．325 μl、PCR 引物 1 μl及 HotStar Taq 酶 0．1 μl。PCR反應條件為:94℃預變性15 min，94℃變性20 s、56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行45個循環;最后72℃延伸3 min。反應體系包括1．53 μl水、0．17 μl SAP 緩沖液、0．3 U 堿性磷酸酶;該反應在37℃進行40 min，然后85℃、5 min使該酶失活。堿性磷酸酶處理后，對SNPs行單堿基延伸:94℃預變性30 s，94℃變性5 s，52℃退火5 s，80℃延伸5 s，共40個循環;最后72℃延伸3 min。

1．2．3 樣本分析 采用美國 Sequenom公司產MassARRAY系統，將最終的分型產物點樣到一塊384孔的spectroCHIP上，用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)進行分析;結果由MassARRAY RT軟件讀取并完成基因分型分析。

2 結果

2．1 PC細胞株DPYD基因的SNPs位點基因型SW1990、PANC-1、CFPACPC細胞株 DPYD基因的rs1801159位點基因型均為A/A純合子，rs1801160位點基因型均為G/G。CFPAC細胞株DPYD基因的rs17376848位點基因型為A/G，PANC-1、SW1990細胞株的rs17376848位點為A/A純合子。

2．2 PC細胞株MTHFR基因的SNPs位點基因型 PANC-1、CFPACPC細胞株 MTHFR基因的rs1801131位點基因型為A/C雜合子，rs1801133位點基因型為C/C;SW1990細胞株MTHFR基因的rs1801131位點基因型為A/A純合子，rs1801133位點基因型為T/T純合子;三株細胞MTHFR基因的rs2274976基因型位點均為G/G純合子。

3 討論

在腫瘤化療中，相同病理類型、分期及方案化療患者的療效、生存期和毒副反應有時截然不同，即“同藥不同效”現象。這種現象與抗腫瘤藥物在腫瘤患者的藥動學和藥物效應毒性個體差異有關［2］，相關基因的SNPs是其產生的主要原因。藥物代謝酶參與多種藥物的代謝活化或解毒，其酶基因多態性對腫瘤化療反應及預后的影響正引起越來越多學者的關注。

DPD是5-FU代謝失活的限速酶，約80%的藥物在肝臟中經DPD分解代謝為無活性產物二氫氟尿嘧啶。DPD由DPYD編碼產生，DPYD堿基突變可能引起DPD結構及活性改變。目前發現，至少40余種突變與DPD活性下降及氟化嘧啶類藥物毒性反應有關。Saif等［3］對1例應用5-FU后發生嚴重血液及神經系統毒副作用的晚期PC患者進行DPYD檢測，發現DPYD IVS14+1 G＞A及DPYD*2A是引起DPD缺乏的最常見多態性。Shahrokni等［4］報道1例與5-FU治療相關的心臟毒副反應的PC患者，認為DPYD p453L(1358 C＞T)可能是5-FU為基礎化療發生嚴重毒副作用的潛在因素。

MTHFR是葉酸代謝的關鍵酶，其基因多態性與葉酸濃度及其在細胞內的分布有關，進而影響腫瘤細胞生長。目前發現，C677T、A1298C是常見與MTHFR活性相關的 SNPs。Suzuki等［5］研究認為，包括MTHFR在內的一碳代謝相關基因多態性可改變飲酒與PC發生危險性的相關性。另有研究發現，MTHFR C677T與 PC發病危險性相關［6］。此外，MTHFR可將還原型葉酸轉變為5-甲基四氫葉酸，削弱5-FU的抗腫瘤作用，影響患者對化療的敏感性。

MALDI-TOFMS是近年生物大分子檢測領域開展的新技術，目前，國外已利用該技術的高精確度和靈敏度進行基因組SNPs檢測［7］;有關研究檢測的DPYD基因的三個SNPs位點［A1764C(rs1801159)、G2331A(rs1801160)、T2033A(rs17376848)］及MTHFR基因的三個 SNPs位點［G1965A(rs2274976)、A1515C(rs1801131)及 C894T(rs1801133)］均為基因編碼區的錯義SNPs，其堿基突變可導致相應的氨基酸改變，可能引起DPD及MTHFR活性改變，影響氟尿嘧啶類藥物的體內代謝，且與氟尿嘧啶類藥物的療效及毒副反應相關。本研究采用MALDI-TOFMS對三個PC細胞株的SNPs進行檢測，發現PANC-1、CFPAC及SW1990細胞株的DPYD基因rs1801159、rs1801160位點基因型及MTHFR基因的rs2274976位點基因型相同，其余SNPs位點基因型均不完全相同。

總之，我們認為檢測PC細胞株中DPYD基因、MTHFR基因的SNPs位點基因型，是腫瘤細胞耐藥及耐藥逆轉研究的基礎，可應用于臨床預測氟嘧啶類藥物的療效及毒副反應，使患者在選用最佳藥物方案、劑量及最大限度地降低藥物毒副反應方面受益。因單一藥物基因多態性對腫瘤化療反應的作用相對較小，故需結合臨床更大的標本量進行更深入的研究。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al．Cancer statistics［J］．CA Cancer J Clin，2007，57(1):43-66．

［2］Elsayad YA，Sausville EA．Selected novel anticancer treatments targeting cell signalling protein［J］．Oncologist，2001，6(6):517-537．

［3］Saif MW，Ezzeldin H，Vance K，et al．DPYD*2A mutation:the most common mutation associated with DPD deficiency［J］．Cancer Chemother Pharmacol，2007，60(4):503-507．

［4］Shahrokni A，Rajebi MR，Harold L，et al．Cardiotoxicity of 5-fluorouracil and capecitabine in a pancreatic cancer patient with a novel mutation in the dihydropyrimidine dehydrogenase gene［J］．JOP，2009，10(2):215-220．

［5］Suzuki T，Matsuo K，Sawaki A，et al．Alcohol drinking and onecarbon metabolism-related gene polymorphisms on pancreatic cancer risk［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17(10):2742-2747．

［6］Nisevic I，Dinic J，Nikolic A，et al．MTHFR C677T polymorphism in chronic pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma［J］．Cell Biochem Funct，2008，26(6):659-663．

［7］Bray MS，Boerwinkle E，Doris PA．High-throughput multiplex SNP genotyping with MALDI-TOF mass spectrometry:problems and promise［J］．Hum Mutat，2001，17(4):296-304．