顯微鏡變顯“納”鏡了！

林宮玄

顯微鏡的 納米時代

在17世紀光學顯微鏡發明后，微米（1微米=10-6米）大小的細胞映在人類眼前，開啟了微生物學。1873年，恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）證明了光學顯微鏡的分辨率只能達到光波長的1/2左右，稱為阿貝極限。而人類所能看到的光波長在400納米（1納米=10-9米）到700納米左右，因此200納米或0.2微米一直是一般光學顯微鏡分辨率無法突破的瓶頸。

在光學顯微鏡發明后的幾百年間，微米左右的物體一直是人類所能觀察到的最小尺度。直到20世紀初電子顯微鏡的問世，人類才開始看到納米大小的物體。但是“顯納鏡”這個詞并沒有被廣泛使用。現今，顯微鏡已不代表是只能看見微米尺度的儀器。顯微鏡的功用是將微小物體的影像放大，使肉眼能夠看見。不過生活用語中的顯微鏡，仍大多指光學顯微鏡。

既然電子顯微鏡的分辨率能看到納米物體，為什么一般光學顯微鏡仍是生命科學領域重要的研究工具呢？主要原因在于電子顯微鏡只能觀察經過冷凍切片處理的生物樣品。換言之，樣品是死的。原子力顯微鏡也是擁有納米分辨率的儀器，目前已發展到可觀察水中的活細胞。然而原子力顯微鏡只能觀察到樣品表面的形貌，無法看到細胞內部的構造。雖然一般光學顯微鏡的分辨率遠比電子顯微鏡與原子力顯微鏡分辨率差，但是具有觀察活細胞內部構造隨時間變化的優勢。因此，光學顯微鏡至今仍是研究生命科學很普遍的利器。2014年，瑞典皇家科學院將諾貝爾化學獎頒給了美國霍華德·休斯醫學研究所的艾力克·貝吉格（Eric Betzig）、德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所的斯特凡·赫勒（Stefan Walter Hell），以及美國斯坦福大學的威廉·莫厄納（William Esco Moerner）三人，表揚他們將光學顯微鏡帶到納米世界的貢獻。

TIPS

什么是納米？

納米又稱毫微米，是一種長度單位，1納米為1/100萬毫米，也就是1/10億米。 納米科技是本世紀重要的尖端科技之一，全世界先進國家均投入大量經費在這跨物理、化學、生物、材料與工程等領域的項目上。

突破 阿貝極限

超解析熒光顯微鏡的發明使顯微技術出現了新的契機。所謂“超解析”的意思是突破阿貝極限，讓分辨率達到幾十納米，使科學家可以觀察活細胞內納米物體的變化，譬如研究分子如何在腦內神經細胞之間形成突觸。

阿貝極限雖證明了一般光學顯微鏡的分辨率，但科學家們仍然想盡各種辦法希望能夠突破阿貝極限，直接看到超高分辨率的光學影像。使用近場光學掃瞄顯微鏡便是其中一個直接的方法。其原理與原子力顯微鏡類似，利用光纖當作針尖，以非常靠近待測物表面至幾個納米的距離，掃描待測物的光信號。雖然近場光學顯微鏡可利用微小的針尖達到20納米的分辨率，但是針尖越小，收光效率越差，在生物影像應用上沒有得到好的成效。

另一方面，如果對于照明光源的物理特性了如指掌，也可經由數學分析，得到超解析光學影像。譬如，構造化照明顯微術借由控制照明光的周期圖案與待測物的干涉形成云紋圖形，并將影像經過計算后，其分辨率可突破阿貝極限。經由數學方法，構造化照明顯微術可以將一般光學影像的分辨率提高到兩倍以上。臺灣“中央研究院”應用科學研究中心李超煌博士所發明的超解析光學顯微鏡，也是利用調控光源與待測物的交互作用，借由影像后處理得到小于200納米的分辨率。

TIPS

阿貝極限

19世紀末，德國物理學家恩斯特·阿貝指出：光學顯微鏡分辨率的極限，大約是可見光波長的一半。可見光中波長最短的是藍紫光，其波長在0.4微米左右。因此，如果兩點之間的距離小于0.2微米，我們將無法分辨出這是兩個點。這就是通常所說的“阿貝極限”。阿貝極限使我們無法更加深入地了解微觀世界，例如病毒的直徑通常就在0.02～0.3微米，無法用已有的光學顯微鏡觀察清楚。

神奇的 綠熒光蛋白質

熒光分子在受到高能量（短波長）的光激發以后，會放出較低能量（長波長）的光，稱為熒光。熒光顯微鏡已經是生命科學中很常見的研究工具。綠熒光蛋白質的發現，使得細胞不必經由額外熒光染色便可直接觀察，成為活細胞動態變化觀察的強力工具。因此，諾貝爾獎在2008年表彰綠熒光蛋白質的合成技術，它讓熒光顯微鏡能用來觀察活細胞的形態變化。

1989年，莫厄納首度量測到單一分子對光的吸收，開啟了單一分子的研究領域，吸引許多科學家投入。1997年，莫厄納在單一綠熒光蛋白質分子的突變體上有重要的發現，引發了許多利用光活化來控制綠熒光蛋白質發光的研究，譬如2002年，美國國家衛生院的利平科特·施瓦茨（Jennifer Lippincott-Schwartz）在美國《科學》（Science）期刊發表了一種綠熒光蛋白質突變體：原本不會發光的綠熒光蛋白質突變體，在413納米激光照射后會變成活化態，被488納米激光發可放出熒光（509納米）;而在持續以488納米光的激發下，分子最后會因為光褪色效應，無法再被活化而放出熒光。

不斷提升的 影像分辨率

1995年，貝吉格提出了利用熒光分子提高分辨率的想法：如果將不同顏色的熒光分子均勻染色在樣品中，讓每個顏色的熒光分子間距都大于阿貝極限，則可利用點擴散函數將分子精準定位。只要將每個顏色的定位影像組起來，即使不同顏色的熒光分子距離只有幾納米，還是能解析出來。不過，要把這個想法實現很困難。譬如要如何將不同顏色的熒光分子均勻染色？

多年后，貝吉格看到了2002年施瓦茨在《科學》期刊發表綠熒光蛋白質的獨特光學性質結果，讓他有機會實現在1995年提出的想法。他發現實驗并不需要區分熒光顏色，還是可以利用不同時間活化綠熒光蛋白質的方式，來組合超高解析影像。貝吉格把這個技術稱為光活化定位顯微術，就是將會發光的蛋白質接在溶小體（細胞胞器）的膜上，利用此顯微術得到超解析度的溶小體熒光影像，并于2006年與施瓦茨合作，成功實現了這個想法。同年，美國哈佛大學的莊曉薇也參考了貝吉格1995年的構想，實驗證實利用其他生物常用的熒光分子隨機發光特性，也可達到超分辨率，并命名為隨機光學重建顯微術。

過去的20年，赫勒也一直想著如何突破阿貝極限，而他是從熒光分子的“受激放射”性質著手，想到了一個利用熒光的開關來提升影像分辨率的方法，于1994年發表了受激放射耗乏顯微術。2000年以后，赫勒開始實驗證明這個想法是可行的。他結合激發激光與受激放射耗乏激光，聚焦在熒光分子染色的生物樣品上，借由納米精確度的掃描，可得到超解析熒光影像。

TIPS

自發性放射與受激放射

熒光分子有基態、激發態等形態。當激發光源將電子從基態躍遷到激發態后，電子能量會在0.1納秒內從高振動態遞減，并在最低振動態停留幾納秒。最后當電子躍遷到基態中任何一個振動態而放出的光，即稱為自發性放射，一般熒光顯微鏡所觀察的光即是自發性放射的熒光。然而，若電子在激發態時，遇到另一道光剛好對應在電子可躍遷的能量時，電子會受到刺激而馬上躍遷到基態并放出光，即受激放射。

向三維納米分辨率邁進

超解析熒光顯微鏡提供了發明光學顯微鏡一個不同的思維。在沒有利用熒光分子的特殊性質前，超解析光學顯微鏡是利用對光性質的了解去設計的，與所要觀察的樣品無關。超解析熒光顯微鏡的原理所帶來的啟發，是可以針對觀察物的性質，譬如熒光的開關控制行為來進一步提升光學影像分辨率。臺灣有一部分研究就是受到這個概念所啟發，譬如臺灣“中央研究院”原子與分子科學研究所張煥正博士利用熒光納米鉆石發展受激放射耗乏顯微術，臺大物理學系朱士維教授利用金納米粒子的飽和作用，達成超解析光學影像;筆者就讀臺大光電工程學研究所時與指導教授孫啟光發表了利用脈沖激光在氮化銦鎵納米薄膜產生音波的非線性效應，突破阿貝極限取得納米分辨率超音波影像。

結合人類原本就對光傳播性質的了解，利用調控光源與待測物的交互作用，以及熒光分子的特殊性質，讓超解析熒光顯微鏡的發展更快。譬如構造化照明顯微鏡，可借由熒光分子的飽和效應進一步提升分辨率，稱為飽和構造化照明顯微術。超解析熒光顯微鏡也搭配光源的分析，進一步發展出三維納米分辨率的光活化定位顯微術、三維隨機光學重建顯微術、三維受激放射耗乏顯微術等。

雖然超解析熒光顯微鏡已經證明可以直接觀察活細胞內納米等級的蛋白質與胞器，然而科學家是不會永遠滿足于目前的分辨率。超解析熒光顯微鏡的分辨率有賴于好的熒光分子特性，譬如開關的控制或隨機性，及被激光打壞的功率上限;研制出好的熒光分子，以更方便地染在活細胞里，這是一條很清楚的路。

顯微鏡除了在分辨率上的追求，科學家也希望提升影像速度，方便觀察細胞內快速的動態行為，目前這些技術最快也需要1秒左右取得一張高解析二維影像。為了解決影像速度的問題，近幾年來，光片照明顯微術開始蓬勃發展，今年從貝吉格實驗室回國的陳壁彰博士也開始在臺灣“中央研究院”應用科學中心研究光片照明顯微術。

隨著顯微技術的不斷提高和進步，我們期待更好的光學顯微鏡讓科學家未來在生命科學領域有更多的突破和發現，幫助人類對抗疾病，改善人類的生活。