過氧乙酸對采后李果實(shí)褐腐菌抑制作用的研究

張曉瑜　張曉宇　王艷偉

摘要： 通過離體抑菌試驗(yàn)，研究過氧乙酸對李果實(shí)褐腐菌（Monilinia fructicola）的抑制效果。結(jié)果表明，0.018%～0.360%的過氧乙酸處理1～30 min對褐腐菌孢子的抑制率達(dá)99.9%以上；過氧乙酸對褐腐菌的MIC和MBC均為0.003%。李果實(shí)接種褐腐菌孢子后20 ℃貯藏72 h，0.27%過氧乙酸浸泡1 min，褐腐病發(fā)病率顯著降低，病斑面積也顯著減小，且不影響果實(shí)外觀品質(zhì)。

關(guān)鍵詞： 過氧乙酸； 褐腐菌（Monilinia fructicola）； 抑制作用； 李果實(shí)

中圖分類號：S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3659-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.018

Abstract： Through in vitro bacteriostasis experiment， the inhibition effect of peroxyacetic acid against Monilinia fructicola on plum fruits was studied. The results showed that inhibition rate of M. fructicola was more than 99.9% when treated in 0.018%～0.360% peroxyacetic acid within 30 min. MIC and MBC of peroxyacetic acid were both 0.003%. The incidence of M. fructicola and disease spot area were significantly reduced when plum fruit with vaccinated M. fructicola spores storage 72 h at 20 ℃ was treated with 0.27% peroxyacetic acid within 1 min， and fruit appearance quality was not affected.

Key words： peroxyacetic acid； Monilinia fructicola； inhibition effect； plum fruit

李果實(shí)成熟于夏季高溫季節(jié)，采后極易受到病原菌的侵染而發(fā)生腐爛、造成經(jīng)濟(jì)損失。其中，由褐腐菌（Monilinia fructicola）侵染引起的褐腐病是李果實(shí)在貯藏期間發(fā)生的主要病害，是導(dǎo)致果實(shí)腐爛損失的主要因素。目前李果實(shí)病害的防治研究與應(yīng)用主要有低溫貯藏[1]、殼聚糖處理[2]、氣調(diào)保鮮[3]等，均有一定的效果但是成本較高。

過氧乙酸具有高效、低毒、廣譜殺菌的特性，對細(xì)菌繁殖體、芽孢、病毒、真菌均有殺滅作用[4，5]，而且價(jià)格低廉；此外，過氧乙酸分解產(chǎn)物是醋酸、水和氧，對環(huán)境無污染，對人體無損害。李和生等[6]將過氧乙酸應(yīng)用于草莓保鮮；Hopkins等[7]將過氧乙酸浸泡方法應(yīng)用于防治西瓜的種源性果斑病。目前過氧乙酸的應(yīng)用主要還是集中在空氣消毒方面[8]，在果實(shí)病害防治方面報(bào)道較少。本試驗(yàn)研究了采用過氧乙酸處理對采后李果實(shí)褐腐病的防治效果，旨在探索李果實(shí)褐腐病防治新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

李果實(shí)采于易縣獨(dú)樂果園，挑選表面光滑、大小均勻、成熟度一致、無機(jī)械損傷和病蟲害的商品熟果實(shí)進(jìn)行隨機(jī)分組。

褐腐菌分離自典型發(fā)病果實(shí)，并經(jīng)過回接確定果實(shí)接種處出現(xiàn)典型發(fā)病病癥。將褐腐菌培養(yǎng)于PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)5～7 d，用含有0.05%吐溫-80的無菌水分別制成濃度為1×107個(gè)孢子/mL和1×105個(gè)孢子/mL的孢子懸液。

過氧乙酸（科密歐化學(xué)試劑有限公司）為二元包裝制劑，使用前將溶液1和溶液2等體積混合，混合后靜置24 h后使用。過氧乙酸有效濃度為18%，使用時(shí)用無菌水稀釋。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 過氧乙酸體外抑菌試驗(yàn) 以過氧乙酸溶液的濃度和時(shí)間為變量處理孢子懸液，每個(gè)濃度和時(shí)間組合重復(fù)3次。在0.5 mL的孢子懸液中分別加入0.5 mL 0.15%、0.30%、0.50%、0.60%、0.75%的過氧乙酸溶液，空白對照為無菌水；混勻后室溫靜置。12 000 r/min離心收集菌體，并用無菌水清洗菌體2次。取0.1 mL無菌水重懸菌體，涂布在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)4～6 d后記錄菌落數(shù)，計(jì)算抑菌率，抑菌率=[（處理前孢子總數(shù)-處理后孢子總數(shù)）/處理前孢子總數(shù)]×100%，其中處理前孢子總數(shù)=0.5×105個(gè)孢子/mL。

1.2.2 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定 最低抑菌濃度（MIC）的測定：取試管數(shù)支，用PDA液體培養(yǎng)基將過氧乙酸溶液進(jìn)行一系列對倍稀釋，濃度分別為0.360%、0.180%、0.090%、0.045%、0.023%、0.011%、0.006%、0.003%、0.001%，以無菌水作為空白對照，每個(gè)濃度重復(fù)3次。各管加入孢子懸液至終濃度為1×105個(gè)孢子/mL。28 ℃培養(yǎng)3～4 d后，以對照有菌絲顯著生長的時(shí)間為觀察和評定MIC的最適時(shí)間，以含抑菌物質(zhì)量低而無肉眼可見菌絲體生長的試管含量為該抑菌物質(zhì)對該病原菌的MIC。最低殺菌濃度（MBC）的測定：在MIC的測定基礎(chǔ)上，取各試管培養(yǎng)液1 mL涂布于新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上，每濃度重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)6 d后，無菌落生長或只生長5個(gè)菌落以下的最低濃度為該抑菌物質(zhì)對該病原菌的MBC。

1.2.3 過氧乙酸果實(shí)抑菌試驗(yàn) 處理后感染：將李果實(shí)在0.27%的過氧乙酸溶液中浸泡1 min，取出自然晾干，在李果實(shí)赤道部位分別刺兩個(gè)孔，每孔注入10 μL孢子懸液。自然晾干，置于塑料框中，并用黑色聚乙烯（PE）袋包裝。

感染后處理：在李果實(shí)赤道部位分別刺兩個(gè)孔，每孔注入10 μL孢子懸液。自然晾干后將李果實(shí)在0.27%的過氧乙酸溶液中浸泡1 min，自然晾干，置于塑料框中，并用PE袋包裝。

對照組：在李果實(shí)赤道部位分別刺兩個(gè)孔，每孔注入10 μL孢子懸液，自然晾干，置于塑料框中，并用PE袋包裝。

以上每組處理30個(gè)果實(shí)，分別于24、48、72 h后記錄發(fā)病率、病斑直徑。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行方差分析，利用Duncans多重比較對差異顯著性（P<0.05）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧乙酸對褐腐菌孢子的抑制作用

過氧乙酸對褐腐菌有強(qiáng)烈的抑制作用，不同的濃度和時(shí)間處理，抑制率均在99.9%以上（圖1）。通過顯著性差異分析，0.018%的過氧乙酸處理與其他濃度的過氧乙酸相比，抑制率偏低，有略顯著的差異（P<0.05），不同的處理時(shí)間對抑制率的影響差異不顯著（P≥0.05）。對褐腐菌來說，過氧乙酸的MIC和MBC均為0.003%（表1），同時(shí)MBC=MIC試驗(yàn)菌株的結(jié)果表明過氧乙酸的抗菌作用是殺菌。

2.2 過氧乙酸對李果實(shí)褐腐病的抑制作用

考慮到過氧乙酸的強(qiáng)氧化性作用和易分解的特點(diǎn)，為了盡量減小氧化作用對李果實(shí)傷害的影響，在果實(shí)抑菌試驗(yàn)中對李果實(shí)進(jìn)行0.27%的過氧乙酸浸泡1 min的處理。感染后處理的李果實(shí)在24、48和72 h的發(fā)病率分別比被感染的對照組果實(shí)低26.67%、46.66%和43.33%，發(fā)病率降低極顯著（P<0.01）；處理后感染的果實(shí)發(fā)病率分別降低13.33%、13.33%和16.67%，發(fā)病率降低顯著（P<0.05）（圖2）。經(jīng)過感染后浸泡處理48 h和72 h后的李果實(shí)病斑直徑顯著小于對照組（P<0.05），而浸泡處理后感染的李果實(shí)病斑直徑與對照組相比差異不顯著（P>0.05）（圖2、圖3）。

3 小結(jié)與討論

褐腐菌離體抑菌試驗(yàn)研究表明，過氧乙酸有顯著的抑菌作用，抑菌作用類型為殺菌；0.27%的過氧乙酸處理1 min對李果實(shí)褐腐病的發(fā)病率有非常顯著的抑制作用，對感染后病斑大小有較顯著的抑制作用。感染后經(jīng)過氧乙酸處理的李果實(shí)相比對照組，發(fā)病率顯著下降，病斑顯著變小；但處理后再感染的李果實(shí)發(fā)病率下降和病斑變小程度較前者略低。說明過氧乙酸的防治作用主要體現(xiàn)在殺滅果實(shí)表面及淺表的病原菌，且作用時(shí)間短。這與過氧乙酸易分解的性質(zhì)相符合。

研究發(fā)現(xiàn)，過氧乙酸短時(shí)浸泡處理對李果實(shí)表皮色澤的影響不大，果實(shí)表皮經(jīng)過氧乙酸處理后及時(shí)晾干，保持原色不變；對經(jīng)過氧乙酸處理的李果實(shí)進(jìn)行感官評定的結(jié)果表明[9]，其外形、色澤、味道等與未經(jīng)處理的同批李果實(shí)未見明顯差異，但浸泡時(shí)間過長（30 min以上）會導(dǎo)致果皮變?yōu)辄S色。

研究結(jié)果表明，采用過氧乙酸防治李果實(shí)褐腐病的方法效果顯著，易操作，成本低，且分解后無有害殘留，不污染環(huán)境，適合李果實(shí)采后貯藏期間褐腐病防治的推廣應(yīng)用。

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