貴州省煙草赤星病病原菌的鑒定

唐承成　曾琛　姜于蘭

摘要：2014年6～10月在貴州煙草主栽區對煙草赤星病病原菌進行了分離鑒定，鑒定出2種病原菌，即鏈格孢菌（Alternaria alternata （Fr.） Keissler）和長柄鏈格孢菌（Alternaria longipes（ELL.&Ev）Mason）。

關鍵詞： 烤煙； 煙草赤星病； 病原菌鑒定

中圖分類號：S432.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3656-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.017

Abstract： From June to October in 2014， pathogenic fungi of tobacco brown spot was separated and identified in tobacco′s main area in Guizhou. 2 kinds of pathogenic fungies had been obtained，which were Alternaria alternata （Fr.） Keissler and A. longipes （ELL & Ev） Mason.

Key words： flue-cured tobacco； tobacco brown spot； pathogenic identification

煙草赤星病于1892年在美國首先被發現，1931年從發病的感染葉片中篩選出其病原交鏈孢菌（A. longipes（ELL.&Ev）Mason），1971年定名為（Alternaria alternata （Fries） Keissler）[1，2]。赤星病具有潛伏期短、流行速度快的特點，在環境有利于發病的情況下，短時間內即可造成大面積流行，給煙葉生產帶來巨大損失。在貴州煙區，通過2004～2008年的調查，全省平均病情指數為1.56，發病較重的年份平均病情指數高達2.51，年度重發病煙區常常造成毀滅性災害。貴州省常年植煙總面積近20萬hm2，每年因赤星病造成的煙葉產值損失平均達2 500多萬元[3，4]。為了更好的防治煙草赤星病，本研究對貴州煙草赤星病進行了病原菌的鑒定。

1 材料與方法

1.1 調查時間和地點

2014年6～10月在貴州煙草主栽區天柱縣、開陽縣、威寧縣、道真縣、興義縣、普定縣等地進行調查。

1.2 病害標本采集

采集到病害癥狀典型的葉片立即拍照、編號、記錄采集人、時間、地點及主要發病特征，并將標本放入經過滅菌的信封中帶回實驗室。

1.3 病原菌的分離純化

在病部有明顯病征處直接挑取菌絲進行分離培養，觀察有分生孢子器并產生大量分生孢子的，用單孢分離法分離病原菌。對于沒有明顯病征的，采用常規分離方法進行病原菌的分離。

1.3.1 單孢分離法 參考邱小燕等[5]的單孢分離法并加以改進。具體方法為，先用75%乙醇消毒30 s后，用無菌水清洗3次。之后用鑷子夾起病斑，置于滅菌濾紙上吸干多余水分，再用剪刀將病斑部分剪下邊長約2 mm小塊。用滅過菌的手術刀將病斑小塊在干凈的培養皿內切碎，然后將其轉至1.5 mL離心管內，加入1 mL無菌水配成孢子懸浮液，再吸取60 μL孢子懸浮液均勻涂布于加入雙抗的PDA平板上。適宜溫度下傾斜放置12 h，最后在10/40倍顯微鏡下挑取萌發的單個孢子于加入雙抗的PDA平板上。

1.3.2 組織分離法 病部葉組織表面經消毒后，切取病葉交接處的組織，移在PDA上培養。表面消毒可用升汞水或用火焰灼燒（不影響組織內的病原），最常用的消毒方法是在75%的乙醇中浸過后將乙醇揮發掉。

1.3.3 病原菌的純化 切取或挑取分離得到的培養物邊緣較純的部分于新的平板培養基上，如此反復幾次，得到病原菌的純培養。

1.4 病原菌的鑒定

以傳統的形態學鑒定為主，對于形態學難以鑒定的疑難屬、種，結合分子生物學方法進行鑒定。

1.4.1 病原菌形態特征觀察 對分離得到的病原菌，觀察其在PDA上的培養性狀，包括菌落的形狀、大小、顏色等，觀察菌絲及分生孢子的形態特征，描述其形態，并測量大小，進行顯微拍照等。然后根據病害組織的癥狀，結合病原菌形態特征進行病原菌鑒定[6，7]。

1.4.2 病原菌的分子生物學鑒定 用CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）法提取病原菌的總DNA，具體步驟如下：①收集培養4～7 d的菌絲約0.2 g，在液氮中迅速研磨成粉末后，把粉末轉入1.5 mL的離心管中，然后加入700 μL 2%CTAB（2%PVP，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl）緩沖液，混合均勻；②于65 ℃水浴鍋中加熱1 h，期間輕輕搖勻3次；③從水浴鍋中取出，冷卻至室溫后，加入等體積（700 μL）的氯仿∶異戊醇（24∶1），顛倒混勻10 min，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，吸取上清液轉入另一離心管；④在上清液中加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10～20 min；⑤4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，倒出上清液；⑥用200 μL 75%乙醇洗滌2～3次除鹽（可置于-20 ℃冰箱中過夜）；⑦37 ℃干燥20 min，沉淀回溶于600 μL ddH2O中，并用等體積的飽和酚（Tris平衡酚）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提1～3次，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，將上清液轉至另一離心管中；⑧用等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提1～3次，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，吸取上清液；⑨于上清液中依次加入1/10體積的4 mol/L的NaAc溶液、2倍體積的無水乙醇，靜置20 min后，4 ℃10 000 r/min離心5 min，收集沉淀DNA；⑩沉淀用200 μL 75%乙醇洗滌2～3次，干燥后溶于適量ddH2O中，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.4.3 PCR及測序 利用真菌核糖體rDNA轉錄間隔區（ITS）PCR擴增的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對提取的總DNA進行PCR擴增，引物由上海捷瑞生物工程技術服務有限公司合成。

PCR擴增反應體系為：9.5 μL ddH2O，12.5 μL 2×Taq MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]，正反引物各1 μL，模板DNA 1 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存。

PCR擴增產物的檢測及測序：經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，BIO–RAD凝膠成像系統觀察、拍照、保存。將產物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，測序結果經BLAST與NCBI數據庫中的已知序列進行同源性比較。根據同源性比較結果，結合病原菌的形態學特征，鑒定出病原菌。

1.5 回接試驗

供接種的離體葉片來自貴州省煙草科學研究所，品種為云煙87。將健康新鮮葉片進行75%乙醇表面消毒，并用無菌水沖洗，用大頭針（高溫灼燒消毒）在葉片兩側的葉基處、葉中部、近葉尖處共6處刺穿，葉片在2×106 個孢子/mL孢子懸浮液中浸泡30 s后瀝干（對照葉片在無菌水中浸泡30 s后瀝干），將葉片置于2層濾紙上，于26 ℃光照培養箱內保濕培養5 d。記錄回接結果，并對回接發病的組織進行癥狀觀察記錄和病原菌的分離，如果回接發病組織的癥狀與煙草赤星病癥狀相同或相似，且分離得到的培養物與之前回接上去的一致，則確認此菌為煙草赤星病的病原菌。

2 結果與分析

經形態學與分子生物學綜合鑒定分析，病原菌有2種，一種為鏈格孢菌，另一種為長柄鏈格孢菌，這兩種菌均為半知菌亞門鏈格孢屬。

2.1 鏈格孢菌

形態特征：菌落圓形，正面黑色，疏松，產生圈狀的輪紋，發病葉片保濕12 h后有菌絲產生，出現少量煤層。光學顯微鏡觀察發現，產孢1 d后的未成熟孢子橢圓形，無色或淺黑色，單孢。4～5 d后分生孢子成熟，棕黑色，倒梨狀，有1～7個橫隔，0～3個縱隔，孢子呈珠串狀或放射狀，每條鏈上的分生孢子不超過5個。有些分生孢子會產生假喙，有些假喙比孢身長。成熟的分生孢子大小為29.2 μm× 11.2 μm（圖1）。

分子生物學鑒定：以菌株HGUP1606（病葉分離得到）基因組DNA為模板，以ITS1和ITS4引物進行PCR擴增，產物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，得到HGUP1606的ITS區序列，經BLAST并與NCBI數據庫中的已知序列進行同源性比較，鑒定結果為鏈格孢菌。

2.2 長柄鏈格孢菌

形態特征：菌落圓形，正面黑色，疏松，產生圈狀的輪紋，發病葉片保濕12 h后產生大量煤層。菌落在PDA上與PCA上有很大的差別，在PDA上菌落也是圓形，但是輪紋不明顯。菌落上還出現白色的菌絲。在煙葉上的孢子與PCA上的孢子更加相近，PDA上的營養物質與煙葉本身相差較大，因此在PDA上產生的分生孢子與前兩者有一定的差異性。光學顯微鏡觀察發現，4～5 d后分生孢子成熟，棕黑色，倒梨狀，有1～7個橫隔，0～3個縱隔，孢子呈珠串狀，無假喙，呈單鏈，每條鏈上有4～10個孢子。成熟的分生孢子大小為29.6 μm×10.9 μm（圖2）。

分子生物學鑒定：以菌株A225基因組DNA為模板，以ITS1和ITS4引物進行PCR擴增，產物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，得到菌株A225的ITS區序列，經BLAST并與NCBI數據庫中的已知序列進行同源性比較，鑒定結果為長柄鏈格孢菌。

2.3 回接鑒定

經回接保濕培養5 d后，能產生煙草赤星病的典型癥狀，并重新分離分別得到鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌2種病原菌。

3 小結

通過對貴州煙草主栽區煙草赤星病真菌病害調查及標本采集和病原菌的分離鑒定，得到貴州煙草赤星病上2種病原菌，但是欠缺的是并沒對2種病原菌進行進一步病原菌致病力強弱的研究，同時有關報道稱煙草赤星病病原菌有第三個種[8]，但是在貴州并未發現，有待進一步調查研究。

參考文獻：

[1] LUCAS G B. Alternaria alternata （Fries） Keissler， the correct name for A. tenuis and A. Longipes[J].Tobacco Science，1971， 15：37-42.

[2] NORSE D. Some factors influencing spore germination and penetration of Alternaria longipes[J]. Annals of Applied Biology，1973，74（3）：297-306.

[3] 徐亞中，謝德平，李花亭，等.煙草赤星病發生流行規律和藥劑防治研究[J].中國煙草，1993（1）：18-21.

[4] 劉許生，孔繁武，廖和平.烤煙赤星病發生與氣象因子的關系及預測模式建立[J].江西植保，2005，28（4）：152-153.

[5] 邱小燕，湯智鵬，張 敏，等.一種適用于多數植物病原真菌的單孢分離方法[J]安徽農業科學，2011，39（9）：5263-5264.

[6] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[7] 方中達.植病研究方法[M].第3版.北京：中國農業出版社，1998.

[8] 彭希文，劉光珍，楊永柱，等.云南省煙草赤星病（Tobacco brown spot）病原研究及其防治藥劑的篩選[J].西南農業大學學報，2000，22（2）：153-156.