玉米大斑病菌黑色素合成還原酶基因酵母單雜交報告載體的構建

賈慧 郭麗婕 孟慶江等

摘要：根據玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）黑色素合成還原酶基因St3HNR、St4HNR 5′端側翼序列和酵母單雜交報告載體pHIS2.1多克隆位點，設計了帶有限制性內切酶位點的特異性引物，并以玉米大斑病菌01-23菌株基因組DNA為模板，PCR擴增啟動子區域長度約1 000 bp的片段，雙酶切目的片段及載體pHIS2.1回收并連接，構建2個還原酶基因的酵母單雜交報告載體。結果表明，克隆到啟動子區域長度為998 bp核酸片段，經PCR檢測、測序、酶切鑒定，2個還原酶基因的酵母單雜交報告載體構建成功，為進一步研究還原酶與轉錄因子互作關系及明確黑素素合成調控機制奠定了基礎。

關鍵詞：玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）；黑色素；酵母單雜交報告載體

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）14-3542-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.053

Construction of Report Vectors of Melanin HNreductase Gene of

Setosphaeria turcica in Yeast One-hybrid

JIA Hui， GUO Li-jie， MENG Qing-jiang， CAO Zhi-yan， SONG Ya-feng

（College of Life Science， Agriculture University of Hebei/Hebei Key Laboratory of Physiological and Molecular Plant Pathology，

Baoding 071000， Hebei， China）

Abstract： According to the restriction enzyme sites of melanin biosynthesis promoter region of reductase gene St3HNR， St4HNR and reporter vector pHIS2.1 of Setosphaeria turcica， two pairs of primers containing restriction enzyme sites were designed， the fragment length about 1 000 bp obtained by PCR using genomic DNA of S.turcica 01-23 strain as templet， and double digested by the corresponding restricted enzymes respectively， recycled and connected， constructed the yeast one-hybrid reporter vector of reductase gene. The results showed that the fragment length of two genes were both 998 bp， vectors were successfully constructed by PCR， sequencing， restriction enzyme digestion， and lay the foundation for the study of the transcription factor.

Key words： Setosphaeria turcica； melanin； report vectors of the yeast one-hybrid system

玉米大斑病是玉米（Zea mays L.）的重要葉部病害，病斑呈梭形，直接影響玉米的產量和品質，造成嚴重的經濟損失[1]。玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）是引起玉米大斑病的一種絲狀病原真菌，在其侵入寄主過程中，主要依靠附著胞產生機械壓力穿透植物表皮細胞[2，3]。成熟的附著胞內沉積著一層黑色素，黑色素是由病菌產生的一種非均質的不溶于水的無定形小顆粒狀類多酚聚合體，其作為重要的毒力因子，在維持附著胞內機械壓力方面起著重要的作用。玉米大斑病菌能夠代謝DHN黑色素，其在病菌附著胞壁上的沉積，保證了病菌能夠產生足夠的膨脹壓力而穿透寄主組織致病[4]。對不同病原真菌中DHN黑色素合成途徑的研究結果表明，DHN黑色素合成途徑起始于聚酮體合成酶（Polyketide synthase），其后經2個還原酶（HNreductase）、2個脫水酶（Scytalone dehydratase）和1個氧化酶（Laccases）催化聚合而形成黑色素，另外還存在一個調控黑色素生物合成的轉錄因子（MR）[5]。在玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）、水稻胡麻斑病菌（Bipolaris oryzae）中均存在該轉錄因子，其對黑色素合成酶基因的轉錄具有調控作用[6，7]。河北農業大學真菌霉系與植物病理學實驗室根據其他真菌中已知DHN黑色素調控基因設計引物獲得StMR1基因片段，并通過RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術得到該基因全長。

研究蛋白質與DNA互作的方法很多，包括DNA蛋白質印跡雜交、凝膠阻滯電泳、DNasel足跡法、DNA與蛋白質復合體的電鏡觀察、紫外交聯法、體內交聯與免疫沉淀相結合等[8]。酵母單雜交體系（Yeast one-hybrid system）是一種識別穩定結合于DNA上的蛋白質的研究技術，它是根據DNA結合蛋白（即轉錄因子）與DNA順式作用元件結合調控報告基因表達的原理來研究目的轉錄因子與基因（DNA或cDNA）互作的體系，該方法也是在細胞內分析鑒定轉錄因子與順式作用元件結合的有效方法[9，10]。真核生物中各種轉錄因子在轉錄水平的調控是基因表達調控的主要方式。典型的轉錄因子都有DNA結合區與轉錄激活區（或抑制區），在特定的時間、部位或特定條件（如脅迫條件）下，特定的轉錄因子與靶基因啟動子的順式作用元件特異性結合并相互作用，就可以激活或抑制靶基因的表達[11]。要闡明細胞內各種信號轉導與基因表達的機制，以及細胞對外界環境刺激引起的一系列信號傳遞與應答基因表達調控等機理，鑒定各種調控基因表達的順式作用元件和轉錄因子至關重要。本研究構建了玉米大斑病菌黑色素合成還原酶基因St3HNR、St4HNR啟動子區酵母單雜交報告載體，為探究轉錄因子StMR1和還原酶基因St3HNR、St4HNR的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米大斑病菌菌株01-23、大腸桿菌（Eschrichia coli）DH5α感受態細胞、SDS堿裂解溶液由河北農業大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室保存或制備，pHIS2.1載體由河北農業大學生命科學學院張彩英教授惠贈；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、pMD？誖19-T Simple Vector購自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成與序列測定由生物工程技術（上海）有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 根據St3HNR、St4HNR啟動子區的基因序列和載體pHIS2.1上的多克隆位點分別設計一對引物，并分別添加Sac I、Spe I和EcoR I、Spe I酶切位點，引物序列見表1。采用CTAB法提取玉米大斑病菌01-23菌株基因組DNA[12]，用于PCR反應模板，擴增體系為DNA 2 μL，10×Taq Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，3HPF（4HNF）（10 μmol/L）1.0 μL，3HPR（4HPR）（10 μmol/L）1.0 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序為95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）觀察結果，凝膠回收試劑盒回收擴增產物。

1.2.2 St3HNR、St4HNR基因啟動子區的克隆 將凝膠回收的目的基因片段與pMD？誖19-T Simple Vector 16 ℃連接30 min或過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，隨機挑取白色單菌落于3 mL含100 μg/mL Amp+ 的LB液體培養基中，37 ℃下220 r/min 振蕩培養過夜。取2 μL菌液作為模板，利用pMD19-T Simple載體克隆載體上的通用引物M13+和M13-進行PCR檢測。選取PCR檢測陽性的單克隆測序，將測序正確的陽性克隆分別命名為pMD19-3HNRP、pMD19-4HNRP。

1.2.3 酵母單雜交報告載體的構建 采用SDS堿裂解法制備質粒DNA。將質粒pMD19-3HNRP、pMD19-4HNRP以及pHIS2.1載體分別進行雙酶切，電泳檢測并回收酶切目的片段進行連接反應，連接完畢后轉化大腸桿菌感受態細胞，提取陽性克隆質粒酶切驗證，構建完成St3HNR、St4HNR基因啟動子酵母單雜交的報告載體pHIS-3HNRP、pHIS-4HNRP。

2 結果與分析

2.1 St3HNR、St4HNR基因啟動子片段的擴增

分析St3HNR、St4HNR基因啟動子區序列的酶切位點，結合酵母單雜交報告載體質粒pHIS2.1上的多克隆位點，分別選用限制性內切酶Sac I、EcoR I和Spe I，設計2對帶有酶切位點的特異引物擴增目的片段，分別得到998 bp兩條條帶，與預期大小相符（圖1）。

2.2 St3HNR、St4HNR基因啟動子的克隆

回收純化片段并與pMD？誖19-T Simple Vector連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，轉化后選擇單克隆進行菌液檢測，引物用載體通用引物M13/M17和特異引物3HPF/3HPR和4HNF/4HNR進行PCR擴增（圖2）。選取PCR鑒定為陽性的克隆送生工生物工程技術（上海）有限公司測序，并命名為pMD19-3HNRP、pMD19-4HNRP。

2.3 pMD19-3HNRP、pMD19-4HNRP的酶切鑒定

將與pMD？誖19-T Simple Vector載體連接并且測序正確的單克隆pMD19-3HNRP、pMD19-4HNRP分別用Sac I和Spe I，EcoR I和Spe I進行雙酶切驗證，均得到預期大小的目的條帶（圖3），成功克隆得到St3HNR、St4HNR基因啟動子。

2.4 pHIS2.1載體酶切鑒定

提取pHIS2.1載體質粒，用Sac I和Spe I，EcoR I和Spe I進行雙酶切并回收，得到7 190 bp大小的片段，所得片段與預期結果一致（圖4）。

2.5 St3HNR、St4HNR基因啟動子酵母單雜交報告載體的構建

將pMD19-3HNRP和pHIS2.1質粒載體分別用Sac I、Spe I進行雙酶切，回收目的片段后將帶有相同黏性末端的3HNRP和線性的pHIS2.1連接，得到pHIS-3HNRP重組載體。將pMD19-4HNRP與pHIS2.1分別用EcoR I、Spe I進行雙酶切，回收純化目的片段后再連接，得到pHIS-4HNRP重組載體。pHIS-3HNRP、pHIS-4HNRP重組載體全長約8 200 bp，Sac I與Spe I雙酶切得到大小為7 190 bp和998 bp的條帶，EcoR I與Spe I酶切得到大小為7 190 bp和998 bp條帶，結果均與預期大小相符（圖6），玉米大斑病菌黑色素還原酶基因啟動子的酵母單雜交載體構建成功。

3 小結與討論

目前，在研究DNA-蛋白質相互作用中，酵母單雜交體系主要有以下3種用途：①確定已知DNA-蛋白質之間是否存在相互作用；②分離編碼結合于目的順式調控元件或其他短DNA結合位點蛋白的新基因；③定位已經證實的具有相互作用的DNA結合蛋白的DNA結合結構域以及準確定位與DNA結合的核苷酸序列[13]。應用酵母單雜交體系已經識別并驗證了許多與目的DNA序列結合的蛋白質。

StMR1基因是DHN黑色素合成途徑中的具有轉錄調控作用的轉錄因子，St3HNR、St4HNR基因是該途徑中編碼還原酶的基因。據報道，瓜類炭疽病菌、玉米小斑病菌中調控基因CMR1的轉錄產物直接或間接作用于還原酶基因，影響其表達，進而影響黑色素的合成[5，6]。本試驗構建了玉米大斑病菌黑色素合成還原酶基因St3HNR和St4HNR的酵母單雜交報告載體，為其研究調控基因的互作機制奠定了基礎。

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