shRNA靶向沉默HSV—2 UL54基因在HEK293細胞內的表達

呂延成　潘曉瑜　黃暢等

摘要：根據乙型單純皰疹病毒（HSV-2）UL54基因序列，設計并合成特異性的小干擾片段，將其定向克隆至真核表達載體pGPU6/GFP/Neo中，經脂質體介導轉染HEK293細胞，倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測轉染效率，MTT法檢測HEK293細胞的存活率，RT-PCR檢測UL54基因mRNA的表達，Western blot檢測UL54基因編碼蛋白質的表達，終點滴定法測定細胞上清液中的病毒感染滴度。結果顯示， shRNA1081能抑制UL54 基因mRNA和蛋白質的表達，能顯著降低子代病毒滴度，提高細胞的存活率。表明本研究構建的重組表達載體pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA能在HEK293細胞中表達，并抑制HSV-2復制。

關鍵詞：UL54基因；RNA干擾；短發夾RNA；真核表達載體；2型單純皰疹病毒

中圖分類號：R373 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3779-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.052

Abstract： In search of new anti-virus strategy，targeting herpes simplex virus type 2 （HSV-2） UL54 gene and based on the rule of shRNA design， DNA fragment targeting conserved sequences of UL54 was synthesized and cloned into a plasmid vector pGPU6/GFP/Neo， and then transferred into human embryonic kidney（HEK） 293 cells by lipofectamine. Parameters including transfection efficiency，cell survival rate， expression level of UL54 mRNA and protein， and viral titer in supernatants collected from HSV-2 infected cell， were detected by fluorescence microscopy and flow cytometry，MTT，real-time fluorescent quantitative PCR， western blotting， and end-point assay respectively. The results showed that， shRNA1081 inhibited UL54 mRNA expression and significantly decreased target gene protein expression， markedly reduced TCID50 in HSV-2 infected cells at 48 hours post-infection， and increased survival rate of cells. It revealed that pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA could express in HEK 293 cells and inhibit HSV-2 replication.

Key words：UL54 gene； RNA interference； shRNA； eukaryotic expression vector； herpes simplex virus type 2

生殖器皰疹（Genital herpes， GH）是一種反復發作、難以控制的潰瘍性疾病，主要由2型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV-2）引起，目前還無特效藥物控制HSV-2的感染和復發。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種特異性基因沉默技術，能夠使mRNA發生降解而導致基因表達沉默，它為靶向防治HSV-2提供了新思路。目前國內外運用RNAi技術特別是針對HSV-2的研究報道較少，其中絕大多數都是直接應用化學合成的siRNA（Small interfering RNA）針對HSV-2進行干擾[1，2]，但是化學合成的siRNA通過脂質體介導進入細胞易被RNase降解，沉默效應持續的時間較短。本試驗采用的是通過構建帶有RNA聚合酶Ⅲ啟動子的重組表達載體，轉錄出具有發夾結構的雙鏈RNA（Small hairpin RNA， shRNA）。shRNA在Dicer酶作用下轉化成21～25 nt的siRNA，可使構建載體在細胞內表達的siRNA持續時間長，穩定性強，是一種較理想的RNAi研究方法。

HSV-2是雙鏈線性DNA，基因組約為150 kb，編碼70多種蛋白質。HSV-2基因組表達具有很高的時序性，按照基因表達的先后順序可將HSV-2病毒基因分為立即早期基因、早期基因和晚期基因，其中有多個基因在病毒復制和繁殖的過程中發揮重要作用，這些主要功能基因都可能成為RNAi抑制HSV-2的靶基因。立即早期基因編碼5種細胞感染蛋白質（Infect cell protein，ICP），包括ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47。UL54基因屬于HSV-2立即早期基因，編碼的ICP27蛋白質是HSV-2病毒復制所必需的一種關鍵多功能蛋白質，主要調節病毒和宿主細胞mRNA的合成與成熟，運輸細胞核的mRNA到細胞質中[3，4]，能激活病毒晚期基因的表達，并與ICP0、ICP4一起調控早期基因和晚期基因的表達[5-7]，刺激病毒轉錄翻譯[8]。有研究證明，ICP27蛋白質一旦突變可影響病毒在宿主內的復制[9，10]，在病毒的激活過程中可以激活p38與JNK信號通路而使細胞發生調亡，因此ICP27被認為在病毒激活過程中起著重要作用。所以編碼ICP27蛋白質的UL54基因應是特異siRNA干擾的考慮位點。因此，針對HSV-2 UL54基因篩選設計合適的干擾位點，構建4個shRNA重組表達載體，建立pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA在人胚胎腎細胞（HEK293）中高表達的模型，篩選出有效抑制UL54基因表達的shRNA干擾序列，為進一步研究利用RNA干擾技術抑制HSV-2復制作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HSV-2 333標準株來源于美國細胞收藏中心，HEK293和Escherichia coli DH5α由遵義醫學院中心實驗室提供，質粒pGPU6/GFP/Neo為上海吉瑪制藥技術有限公司產品，限制性內切酶BamH Ⅰ、BbsⅠ、Pst Ⅰ為美國Fermentas公司產品，T4 DNA連接酶為杭州碧云天生物技術研究所產品，RNA提取試劑TRIzol、SYBR？誖 PrimeScript？誖 RT-PCR Kit為寶生物工程（中國大連）有限公司產品，DMEM培養基為美國GIBCO公司產品，新生牛血清為杭州四季青公司產品，轉染試劑Lipofectamine2000為Invitrogen公司產品，鼠抗ICP27單抗為Abcam公司產品，PCR引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 短發夾RNA（shRNA）靶序列的設計

從GenBank上獲得HSV-2（NC_001798）UL54基因序列，按照shRNA設計原則，針對HSV-2的UL54基因序列保守區域各篩選設計、合成4條干擾靶序列，分別命名為UL54 shRNA1081、UL54 shRNA1092、UL54 shRNA1276、UL54 shRNA1407，同時設計不針對任何基因的序列為陰性對照（Negative control，NC）。所設計的寡核苷酸鏈由上海吉瑪制藥技術有限公司化學合成，詳見表1。

1.3 pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA表達載體的構建和鑒定

合成編碼發夾結構shRNA的正義鏈和反義鏈分別用無核酸酶的無菌水稀釋成50 mol/L，按照退火緩沖液的說明配制退火反應體系（Nuelease-free water 40 μL，退火緩沖液20 μL，50 μmol/L的shRNA的正義鏈和反義鏈各20 μL）。退火反應步驟為：95 ℃ 2 min，每8 s下降1 ℃，降至25 ℃。退火產物儲存于-20 ℃。取pGPU6/GFP/Neo空載體用BamH Ⅰ、Bbs Ⅰ于37 ℃酶切2 h，酶切后產物進行瓊脂糖凝膠電泳回收，電泳鑒定后與siRNA小片段進行連接，16 ℃連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5a感受態細胞，涂布于含Kana抗性的LB平板上，37 ℃恒溫培養箱中培養過夜，挑取單克隆菌落接種于含Kana抗性的LB培養液中，37 ℃恒溫搖床培養過夜，收集菌液，小量快速抽提質粒DNA，提取的質粒分別用BamHⅠ、PstⅠ雙酶切鑒定。

1.4 細胞培養和質粒轉染

HEK293細胞用含10%小牛血清的DMEM完全培養基在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下進行常規的細胞培養，每隔2 d換液。選取對數生長期的HEK293細胞，轉染前1 d，在24孔細胞培養板里接種500 μL的HEK293細胞（0.8×105～1.0×105個細胞/mL），37 ℃、5%CO2培養箱中培養至單層細胞匯合度為70%～80%時即可進行轉染。質粒和lipofectamin2000轉染試劑的比例為0.8 μg∶2.0 μL，轉染48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況并利用流式細胞儀檢測轉染效率。

1.5 病毒的接種及子代病毒滴度的檢測

HSV-2感染HEK293細胞，并于顯微鏡下觀察細胞病變，用終點滴定法檢測子代病毒滴度。按Reed-Muench法計算能引起50%細胞發生病變的病毒最高稀釋度（50% tissue culture infective dose， TCID50），即為病毒滴度。

1.6 MTT法檢測HEK293細胞存活率

按0.5×105～1.0×105個細胞/mL細胞密度接種到96孔培養板進行培養，每孔體積100 μL，接種病毒48 h后棄上清，每孔加MTT溶液（5 mg/mL） 10 μL，繼續孵育4 h，終止培養，吸去孔內培養上清液，每孔加入100 μL DMSO，脫色搖床上振蕩10 min，使結晶物充分溶解。以無細胞孔作為空白對照（僅加入MTT和DMSO），利用酶標免疫檢測儀在波長492 nm下測定各孔光吸收值，計算細胞存活率。細胞存活率=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.7 實時熒光定量PCR檢測UL54 基因mRNA的表達

Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA用于后續PCR擴增。采用引物設計軟件PrimerPremier 5.0設計UL54基因和管家基因GAPDH的上下游引物，以GAPDH基因作為內參對照檢測各組細胞內mRNA表達水平，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成，PAGE純化，濃度為0.5 μmol/μL。引物序列如下：UL54基因上游引物：5′-CCAGGACCCTATCATCGGAACG-3′，下游引物：5′-AGTATTTCAATGAGACCCGCCAT-3′；GAPDH基因上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。進行PCR反應：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸32 s（共40個循環）。采用Comparative delta-delta相對定量法計算各組mRNA的表達量。

1.8 Western blot檢測蛋白質表達

提取細胞總蛋白質，采用BCA（Bicinchoninic acid）法測定細胞總蛋白質濃度，Western blot法檢測蛋白質表達，以GAPDH基因為內參，Western blot條帶經Quantity One定量分析軟件進行分析。

1.9 統計學處理

利用SPSS 13.0軟件進行統計分析，所有數據采用平均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結果與分析

2.1 表達載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA酶切鑒定結果

pGPU6/GFP/Neo質粒上有Bbs Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點，在這兩個酶切位點之間還有一個Pst Ⅰ酶切位點。shRNA模板成功插入到質粒pGPU6/GFP/Neo上時， Pst Ⅰ酶切位點被置換，因此重組質粒能被BamH Ⅰ酶切開，不能被Pst Ⅰ酶切。Pst Ⅰ酶切結果顯示有2條帶，分別為超螺旋的SC構型和質粒的松弛開環OC構型，這兩條帶表明重組質粒不能被Pst Ⅰ酶切。重組體被BamH Ⅰ單酶切而線性化，條帶在5 100 bp左右，如圖1所示。

2.2 細胞轉染效率測定結果

pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體轉染HEK293細胞48 h后，綠色熒光蛋白質（GFP）的表達達到高峰。倒置熒光顯微鏡觀察質粒轉染細胞情況如圖2所示，流式細胞儀測得轉染48 h后轉染效率如圖3所示，轉染效率最高達80.8%。

2.3 HSV-2轉染后子代的病毒滴度檢測結果

細胞接種HSV-2 48 h后，收集各組病毒上清液進行病毒滴度的測定，病毒滴度用TCID50計算。通過終點滴定法測定HSV-2的TCID50，以確定感染細胞所需的病毒量。結果（表2）顯示，空白對照組TCID50為10-5.5±0.5 TU/（100 μL），其含義為將該病毒液稀釋10的（5.5±0.5）倍，接種100 μL能使50%細胞發生病變。與空白對照組（空載體）相比，干擾組UL54 shRNA1092、UL54 shRNA1276病毒滴度雖有下降，但差異不顯著（P>0.05）；其余兩干擾組病毒滴度也均有不同程度下降，差異達極顯著水平（P<0.01），其中UL54 shRNA 1081組病毒滴度下降最顯著。

2.4 UL54基因mRNA表達的實時熒光定量PCR檢測結果

接種HSV-2 48 h后，提取各組細胞內HSV-2總RNA，利用實時熒光定量PCR法進行目的基因的mRNA表達水平的檢測，結果（表3）顯示，UL54 shRNA1081組和UL54 shRNA1407組對UL54基因的mRNA表達抑制率分別為69.61%和51.46%，與空白對照（空載體）組相比，具有顯著性差異（P<0.05），而轉染對照組（陰性對照組）與空白對照組相比，無顯著性差異（P>0.05），UL54 shRNA1081對mRNA表達抑制率最高。

2.5 HEK293細胞存活率的MTT法檢測結果

MTT法檢測HEK293細胞存活率，結果（圖4）表明，UL54 shRNA1081組細胞存活率最高，與對照組的細胞存活率相比，差異顯著（P<0.05）。

2.6 HSV-2 UL54基因蛋白質表達的Westernblot 檢測結果

Western blot檢測結果顯示，UL54基因表達的ICP27蛋白質條帶位于63 ku位置（圖5A）。ICP27蛋白質相對表達量用ICP27條帶的灰度值與內參基因GAPDH的灰度值的比值表示，與空白對照組相比，UL54基因各干擾組的蛋白質表達均有不同程度的降低，UL54 shRNA1081組蛋白質表達下降最顯著（P<0.05），其次是UL54 shRNA1276組（圖5B）。

3 討論

本研究針對HSV-2 UL54基因篩選設計合適的4個干擾靶位點，構建shRNA重組表達載體，該載體有GFP表達，便于觀察和檢測轉染效率。經酶切鑒定驗證，成功構建了4個pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA真核表達載體。HEK293細胞是HSV-2的易感細胞，通過脂質體介導的pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA真核表達載體轉染HEK293細胞，利用倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測到大量綠色熒光蛋白質表達，表明裝載到質粒上的基因片段通過脂質體的介導成功轉染到HEK293細胞，且轉染效率達到80%左右，達到試驗要求。結果表明，UL54基因特異性的shRNA1081表達載體能有效抑制HEK293細胞中mRNA和ICP27蛋白質的表達，與空載體相比，mRNA抑制率為69.61%，對蛋白質表達的抑制效果最顯著。此外，本研究還通過觀察子代病毒滴度的變化來反映病毒的復制情況，但是肉眼觀察帶有一定的主觀性，所以還通過MTT法來檢測細胞的存活率，考察shRNA表達載體對宿主細胞的保護情況，與空載體組相比，shRNA1081表達載體能明顯降低子代的病毒滴度，細胞的存活率也最高。證實UL54 shRNA1081表達載體干擾效果較好，說明該shRNA1081真核表達載體能特異降低UL54基因的表達，在一定程度上還抑制病毒的復制，因此UL54基因是一個潛在的有效的抗HSV-2的藥物靶點。另外，RNAi并不能完全阻斷基因的表達，對阻斷基因mRNA的表達有一定的限度[11]，siRNA在細胞內與RISCs（RNA-induced silencing complexes）結合后，通過其識別并沉默相應的mRNA，RISCs有一定的飽和度，過多的siRNA反而可能抑制其活性，也不可能無限增大siRNA的濃度。因此將兩種基因或者多個基因的分子靶向治療相結合有可能治療效果更好。因此，本試驗通過篩選出最有效抑制UL54基因表達的shRNA干擾序列，和前期研究針對不同的病毒關鍵基因如UL29[12]、UL27[13]、ICP4[14]以及已報道的UL30[15]進行多個靶點shRNA的設計、篩選，為下一步利用最有效干擾序列進行聯合干擾HSV-2復制作用奠定了基礎。

參考文獻：

[1] 劉繼峰，關翠萍，唐 旭，等.siRNA對單純皰疹病毒2型ICP4基因抑制作用的研究[J].中華實驗和臨床病毒性雜志，2010， 24（3）：199-201

[2] STEINBACH J M， WELLER C E， BOOTH C J， et al. Polymer nanoparticles encapsulating siRNA for treatment of HSV-2 genital infection[J]. J Control Release，2012，162（1）：102-110.

[3] SEDLACKOVA L，RICE S A. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein ICP27 is required for efficient incorporation of ICP0 and ICP4 into virions[J].Virol，2008，82（1）：268-277.

[4] MALIK P，TABARRAEI A，KEHLENBACH R H， et al. Herpes simplex virus ICP27 protein directly interacts with the nuclear pore complex through Nup62， inhibiting host nucleocytoplasmic transport pathways[J]. Biol Chem，2012，287（15）： 12277-12292.

[5] SANDRI-GOLDIN R M.The many roles of the regulatory protein ICP27 during herpes simplex virus infection[J]. Front Biosci，2008，13（5）：5241-5256.

[6] QING G，WEILI W， FANQIN Z，et al. Research of UL54-specific siRNA on herpes simplex virus type II replication[J]. Int J Dermatol，2011，50（3）：362-366.

[7] HARGETT D， MCLEAN T， BACHENHEIMER S L， et al. Herpes simplex virus ICP27 activation of stress kinases JNK and p38[J].Virol，2005，79（13）：8348-8360.

[8] ZHAO L，ZHU W B，DING Q，et al. The herpes simplex virus type multiple function protein ICP27[J]. Virol，2008，23（6）：399-405.

[9] SANDRI-GOLDIN RM. The many roles of the highly interactive HSV protein ICP27， a key regulator of infection[J]. Future Microbiol，2011，6（11）：1261-1277.

[10] KALAMVOKI M，ROIZMAN B. The histone acetyltransferase CLOCK is an essential component of the herpes simplex virus 1 transcriptome that includes TFIID，ICP4，ICP27，and ICP22[J]. Virol，2011.85（18）：9472-9477.

[11] JACKSON A L，BARTZ S R，SCHELTER J，et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi[J]. Nature Biotech，2003，21（6）：635-637.

[12] 黃 暢，潘曉瑜，袁俊杰，等.單純皰疹Ⅱ型病毒UL29基因shRNA表達載體的干擾效應[J].實用醫學雜志，2014，30（5）：691-694.

[13] 呂延成，潘曉瑜，周丹丹，等.靶向UL27 shRNA抑制Ⅱ型單純皰疹病毒在HEK293細胞中的復制[J].中國生物化學與分子生物學報，2013，29（8）：759-766.

[14] 袁俊杰，呂延成.shRNA表達載體對HSV-2 ICP4基因的干擾效應[J].遵義醫學院學報，2013，36（1）：21-24.

[15] 馮 海，張 浩，屠 靜，等.敲減單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-2）UL30蛋白表達可抑制HSV-2復制[J].中國生物化學與分子生物學報，2007，23（12）：1025-1030.