7-羥基-4-甲基香豆素縮纈氨酸 鄰菲咯啉 銅對乳腺癌MCF-7細胞增殖及凋亡的影響及其作用機制

虞浩，肖秀娣，徐雪松，李巧玉（江蘇大學附屬人民醫院.乳腺外科，.神經外科，江蘇 鎮江 00）

7-羥基-4-甲基香豆素縮纈氨酸 鄰菲咯啉 銅對乳腺癌MCF-7細胞增殖及凋亡的影響及其作用機制

虞浩1，肖秀娣1，徐雪松1，李巧玉2
（江蘇大學附屬人民醫院1.乳腺外科，2.神經外科，江蘇 鎮江 212002）

目的：研究7-羥基-4-甲基香豆素縮纈氨酸鄰菲咯啉 銅（縮氨基酸類銅）在體內外對乳腺癌 MCF-7細胞生物學活性的影響及作用機制。方法：采用 MTT、流式細胞儀及蛋白質印跡法檢測不同濃度縮氨基酸類銅對乳腺癌MCF-7細胞增殖及凋亡的影響。建立 MCF-7荷瘤裸鼠模型后，經過縮氨基酸類銅的干預，繪制腫瘤生長曲線并計算抑瘤率，同時觀察荷瘤裸鼠的毒副反應。結果：縮氨基酸類銅以濃度依賴性方式有效地抑制 MCF-7細胞增殖，抑制MCF-7細胞活力的 IC50為1.1 μmol/L；縮氨基酸類銅能以時間依賴性方式誘導MCF-7細胞凋亡（P＜0.05），且可上調細胞內p53、Bax蛋白的表達，下調Bcl-2蛋白的表達；體內實驗顯示，縮氨基酸類銅體內以濃度依賴性方式抑制乳腺癌 MCF-7移植瘤的生長（P＜0.05），未見明顯的毒副作用。結論:縮氨基酸類銅在體內體外均可明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞的生長，抑癌作用可能是通過上調 p53、Bax蛋白表達和下調 Bcl-2蛋白表達，從而誘導腫瘤細胞凋亡實現的。

縮氨基酸類銅；乳腺癌；MCF-7；凋亡

［Abstract］Objective:To investigate the effect of the copper complexes with aromatic aldehyde derivatives，which was hereinafter referred to as aromatic aldehyde-copper drug，on breast cancer cell（MCF-7 cell line）in vivo and vitro and its mechanism of action.Methods:MCF-7 cells were treated with different concentrations of the aromatic aldehyde-copper drug，MTT assay was performed to determine cell ratio.Cell apoptosis were served by AnnexinV/PI flow cytometry.Western blotting was performed to evaluate the protein expression of p53，Bax and Bcl-2.The subcutaneous transplantable tumor model of MCF-7 cell in nude mice was established.The nude mice in each group received corresponding treated.The growth curves of the tumor were drawn and the tumor growth inhibition rates were calculated，and the toxic and side effort were observed too.Results:Aromatic aldehyde-copper drug effectively inhibited the proliferation of MCF-7 in a dose dependent manner，and the IC50was 1.1 μmol/L.Aromatic aldehyde-copper drug induced the apoptosis of MCF-7 cells in a time-dependent way（P＜0.05），which was accompanied with up-regulation of p53 and Bax expression，while Bcl-2 expression was down regulated.In vivo，aromatic aldehyde-copper effectively inhibited the growth of MCF-7 tumor in a dose dependent manner（P＜0.05）.There was no notable difference in the side effect.Conclusion:Aromatic aldehyde-copper drug may inhibit the proliferation of MCF-7 cells through inducing cell apoptosis，which should be related to the up-regulation of p53 and Bax，while down-regulated Bcl-2.

［Key words］aromatic aldehyde-copper drug；breast cancer；MCF-7；apoptosis

早在 20世紀 60年代，金屬配合物順式二氯二氨合鉑（順鉑）就被確認為具有抗腫瘤活性的臨床藥物［1］。此后，鉑類抗癌藥逐漸成為研究的熱點，并已廣泛應用于臨床，對肺癌、頭頸部惡性腫瘤等具有良好的治療效果。當然，鉑類藥物亦有一些較為明顯的毒副反應，如骨髓抑制、腎毒性、神經毒性等。但隨著藥理作用的進一步明確，眾多高效、低毒的具有抗癌活性的金屬配合物藥物不斷被研發和投入臨床應用。

目前研究發現，含金屬縮氨基酸 鄰菲咯啉類銅藥物具有較強的細胞毒性作用［2-4］，其中Ranford等［5］制備的二價銅與 2，9-二甲基鄰菲咯啉形成的配合物作用最為突出，其細胞毒性與順鉑相似。

鑒于鉑類藥物較嚴重的毒性作用，具有良好抗腫瘤活性的含金屬縮氨基酸 鄰菲咯啉類銅藥物近年來已成為無機抗癌配合物研究的熱點。本研究初步觀察了7-羥基-4-甲基香豆素縮纈氨酸 鄰菲咯啉-銅（縮氨基酸類銅）體內外的抗乳腺癌活性并對其機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

縮氨基酸類銅為蘭州大學化學化工學院惠贈；乳腺癌 MCF-7細胞株購自北京協和細胞資源中心；6孔和96孔細胞培養板為 Corning公司產品，Annexin V/PI試劑盒為 BD公司產品，MTT試劑盒為Sigma公司產品，p53、Bax和 Bcl-2抗體購自圣克魯斯生物技術公司，DMEM細胞培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司。雌性BALB/c裸鼠4周齡，12～16 g，購自揚州大學農學院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測 MCF-7細胞的增殖力 取對數生長期的 MCF-7細胞制成濃度約 1×105/mL單細胞懸液，接種于 96孔培養板，每孔100 μL，實驗組共8個小組（分別加入 0.1，0.3，0.8，1.2，1.8，2.4，3.0，5.0 μmol/L的縮氨基酸類銅）；對照組不予以縮氨基酸類銅處理；調零組單獨加100 μL細胞培養基，每組設 3個平行孔。在 37℃，5％CO2及飽和濕度的培養箱中培養48 h后，每孔加入 MTT 20 μL，繼續培養4 h后加入 DMSO 100 μL，振蕩搖勻后，采用全自動酶聯免疫檢測儀測定各孔在 570 nm波長的光密度（D）值，取每組 3個平行孔的平均值，計算細胞生長抑制率（inhibition ratio，IR）和半抑制濃度（50％inhibiting concentration，IC50）值。IR=［1-（實驗組平均 D值 -調零組平均 D值）/（對照組平均D值-調零組平均D值）］×100％。IC50值的計算:用 Origin 7.0軟件的非線性擬合對縮氨基酸類銅的IR曲線進行擬合，計算出當 IR為 50％時對應的濃度即為半抑制濃度 IC50。

1.2.2 AnnexinV/PI流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數生長期的 MCF-7細胞，以1 μmol/L縮氨基酸類銅分別處理24和 48 h后棄上清，PBS洗 2次；制成濃度為1×106/mL的細胞懸液；吸取100 μL細胞到1.5 mL EP管，加入Annexin V和PI各5 μL進行染色，室溫避光放置15～30 min，加入 400 μL結合緩沖液，采用流式細胞檢測細胞凋亡率，采用Cell Quest軟件系統對結果進行分析。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測 p53、Bax和 Bcl-2蛋白的表達水平 取生長狀態良好的 MCF-7細胞以1× 106/mL接種于 6孔細胞培養板，加入1 μmol/L的縮氨基酸類銅，培養 24、48 h，用細胞裂解液提取蛋白，將樣品經過 SDS-PAGE、電轉膜等后，分別用p53、Bax和 Bcl-2抗體對其進行蛋白質印跡分析。

1.2.4 腫瘤生長曲線及抑瘤率 將培養的MCF-7細胞制備成濃度為 5×106/mL細胞懸液，在每只裸鼠的背部皮下接種 0.1 mL。以皮下腫瘤結節直徑達0.5 cm為成瘤標準，將達成瘤標準后的裸鼠隨機分為3組，每組10只，分別予 0.5，1 mg/kg縮氨基酸類銅（用藥組）及 PBS（對照組）進行腹腔注射，每周1次，共干預3次。每次用藥前用游標卡尺測量腫瘤（包括皮膚厚度在內）短徑（a）及長徑（b），末次用藥后1周及2周繼續測量瘤體大小。按下列公式計算瘤體體積:V=0.52×a2×b，并根據計算結果繪制腫瘤生長曲線。依據末次測量計算出的腫瘤體積計算抑瘤率，計算公式:抑瘤率 =（對照組平均腫瘤體積-用藥組平均腫瘤體積）/對照組平均腫瘤體積 ×100％。

1.2.5 不良反應觀察 每日觀察裸鼠的一般情況，如精神狀態、毛發、食欲、活動變化等。

1.3 統計學分析

應用 SAS 9.2軟件處理數據，數據資料以均數±標準差表示，多組數據經正態性檢驗和方差齊性檢驗后行單因素方差分析，兩兩比較使用 Dun-nett-t檢驗，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 縮氨基酸類銅對 MCF-7細胞生長的抑制作用

MTT結果顯示，隨著作用時間的延長，縮氨基酸類銅對 MCF-7細胞生長的抑制作用逐漸明顯，5 μmol/L時最大抑制率達到82.5％。其 IC50值均接近1.1 μmol/L。見圖1。

圖1 縮氨基酸類銅對 MCF-7細胞生長的抑制率

2.2 Annexin V/PI雙染色分析

流式細胞術檢測結果顯示，1 μmol/mL的縮氨基酸類銅作用于MCF-7細胞24，48 h及PBS對照組的凋亡率分別為 （25.68±6.38）％、（55.67± 9.45）％和（12.23±3.57）％。隨著干預時間延長，細胞的凋亡數明顯增多（F=32.375，P＜0.05）。見圖2。

圖2 Annexin V/PI檢測各組MCF-7細胞凋亡率

2.3 p53、Bax和Bcl-2蛋白的表達

蛋白質印跡檢測結果顯示，縮氨基酸類銅（1 μmol/L）干預 MCF-7細胞 24、48 h后，腫瘤細胞內p53、Bax蛋白的表達逐漸增強，Bcl-2蛋白表達逐漸減弱（圖3）。提示p53、Bax和Bcl-2表達的變化，可能參與了縮氨基酸類銅誘導 MCF-7細胞的凋亡。

圖3 各組 MCF-7細胞 p53、Bax和 Bcl-2蛋白的表達

2.4 荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線及抑瘤率

對瘤體體積的測量和計算結果顯示，縮氨基酸類銅可明顯抑制乳腺癌移植瘤生長，隨著藥物劑量增加，對腫瘤生長的抑制更為明顯（P＜0.05，圖4）。根據末次測量的腫瘤體積進行計算，0.5 mg/kg縮氨基酸類銅組的抑瘤率為42.91％，1 mg/kg縮氨基酸類銅組的抑瘤率達58.84％。

圖43組裸鼠皮下腫瘤在體生長曲線

2.5 不良反應觀察結果

在實驗過程中，治療組的所有荷瘤裸鼠一般精神狀態良好；活動自如；皮毛柔順、光澤；未見明顯食欲減退；各組均無意外死亡小鼠。

3 討論

鉑類抗腫瘤藥進入細胞核后與DNA作用，形成Pt-DNA化合物，繼而引起 DNA復制、轉錄障礙，激活多種信號轉導通路從而誘導細胞凋亡，在卵巢癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤的治療過程中發揮重要作用［6］。但是，鉑類藥物對腎臟、骨髓及神經的毒性作用，特別是腫瘤細胞的耐藥性限制了其在臨床上的應用。因此，尋找鉑類藥物的替代品就顯得十分的迫切。

多項研究［7-9］均證實銅有機金屬配合物是一種潛在的可替代鉑類化合物的抗腫瘤藥物。目前國內外對縮氨基酸類銅的研究以體外抗腫瘤活性為主，暫未對其抗腫瘤機制及動物體內抗腫瘤作用進行詳細探討，因此本研究初步探討其抗腫瘤機制及動物體內抗腫瘤效果。

凋亡是細胞對環境的生理性、病理性刺激信號產生的應答有序的死亡過程，而細胞凋亡過程的失控導致細胞無限制的增殖是引起惡性腫瘤的一個重要原因。因此誘導細胞凋亡是腫瘤治療中的一個有效的切入點，而且比直接殺傷腫瘤細胞更具有優勢［10］。現臨床上應用的多種抗腫瘤藥物都具有一定的誘導腫瘤細胞凋亡作用［11］，其機制考慮與以下幾個方面有關:活性氧成分、活性金屬氧化物成分、核苷堿基的修改、脫氫或氫原子轉移（HAT）以及質子偶合電子轉移（PCET）等［12-13］。本研究通過體外AnnexinV/PI檢測，證實縮氨基酸類銅可以誘導乳腺癌 MCF-7細胞凋亡，而且隨著作用時間的延長，效果也越明顯。在荷瘤裸鼠模型中我們亦觀察到該藥物具有良好的體內抑瘤效果。

有研究表明，原癌基因 Bcl-2蛋白家族與抑癌基因 p53是 重 要的 細 胞凋 亡 調節 因 子［14-15］。p53基因既可以調節細胞周期，亦可以通過上調Bax和下調Bcl-2或Bcl-xL，進而影響細胞線粒體的通透性，從而影響下游的促凋亡基因的功能［14，16］。在本研究中，縮氨基酸類銅干預乳腺癌MCF-7細胞后，細胞中Bcl-2蛋白表達下調，而同時p53和 Bax蛋白的表達明顯上調，提示此通路的激活可能是縮氨基酸類銅誘導細胞凋亡的機制之一。

綜上所述，本研究顯示縮氨基酸類銅在體內外均具有較好的抗癌活性，為今后縮氨基酸類銅應用于人類乳腺癌的治療提供了一定的實驗依據。在后續的研究中，我們將采用多種乳腺癌細胞株進行實驗，全面評價縮氨基酸類銅的抗腫瘤活性。同時，我們將在體內實驗中進一步研究縮氨基酸類銅的體內分布，藥代動力學以及不良反應，為縮氨基酸類銅的臨床應用提供基礎數據。

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Effect and mechanism of the proliferation and apoptosis of the MCF-7 cells on copper complexes with aromatic dldehyde derivatives in vivo and vitro

YU Hao1，XIAO Xiu-di1，XU Xue-song1，LI Qiao-yu2
（1.Department of Breast Disease，2.Department of Neurosurgery，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

R979.1

A

1671-7783（2015）01-0049-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140113

虞浩（1983—），男，江蘇鹽城人，主治醫師，碩士研究生，主要從事乳腺癌的基礎及臨床研究；李巧玉（通訊作者），教授，碩士生導師，E-mail:yuhao_1983@163.com

2014-04-29 ［編輯］陳海林