橋本甲狀腺炎患者血清白介素-17A、γ-干擾素及miRNA-146a的檢測意義

蔣銀芬，丁志祥，孫曉春（1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 1013；.常州市中醫醫院檢驗科，江蘇 常州 13003）

橋本甲狀腺炎患者血清白介素-17A、γ-干擾素及miRNA-146a的檢測意義

蔣銀芬1，2，丁志祥2，孫曉春1，*
（1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.常州市中醫醫院檢驗科，江蘇 常州 213003）

目的：探討白介素-17A（IL-17A），γ-干擾素（IFN-γ）及 miRNA-146a與橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）的關系以及指標間的相關性。方法：應用流式細胞儀 CBA法檢測 32例 HT患者和 30例健康對照血清 IL-17A、IFN-γ的表達水平，應用熒光定量 PCR法檢測血清中miRNA-146a的相對表達水平并檢驗其與 IL-17A和 IFN-γ的相關性。結果：HT患者血清中 IL-17A和IFN-γ的水平分別為（3.42±0.97）pg/mL和（7.20±1.73）pg/mL，明顯高于對照組的（2.38±0.35）pg/mL和（5.60±0.70）pg/mL，差異均有統計學意義（P均＜0.01）；HT患者血清miRNA-146a的相對表達為 0.11±0.26，低于對照組 0.27±0.13，差異亦有統計學意義（P＜0.01）。HT患者 IL-17A與 IFN-γ表達有相關性（r=0.307，P=0.015）；而 miRNA-146a與 IL-17A（r=-0.059，P=0.648）、IFN-γ（r=-0.218，P=0.089）之間均無明顯相關性。結論:IL-17A、IFN-γ在HT患者血清中均呈高表達，而miRNA-146a低表達，提示三者參與了HT的發病進程，有可能作為 HT診斷的參考指標。

橋本甲狀腺炎；IL-17A；IFN-γ；miRNA-146a

橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）又名慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，是一種以自身甲狀腺組織為抗原的慢性自身免疫性疾病。在環境和某些遺傳因素共同作用下產生自身抗體及相關細胞因子，破壞正常甲狀腺組織。研究發現Th1和 Th2及相關細胞因子參與了自身免疫性疾病的發生發展［1］，其中 IL-17A和 IFN-γ是主要的相關細胞因子。miRNA是一類短小（20～24 nt）的非編碼 RNA，在自身免疫性甲狀腺炎中發揮重要的作用［2-3］。而 miRNA-146a是主要參與免疫調節的 miRNA分子之一［4］。本實驗通過檢測患者血清中 IL-17A、IFN-γ 及miRNA-146a的表達水平初步探討其在 HT診斷中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象

HT組來自2014年1月至 7月來常州市中醫醫院內分泌科治療的患者共 32例，其中男13例，女19例，平均年齡（42.2±11.8）歲。HT的診斷符合《中國甲狀腺疾病診治指南》的標準，同時排除其他自身免疫性疾病、感染、腫瘤、妊娠等其他內科疾病及使用激素者。對照組為同期體檢的健康者共30例，其中男12例，女18例，平均年齡（40.3±10.7）歲。HT組與對照組的年齡、性別差異無統計學意義。

1.2 標本采集和處理

晨起空腹采集靜脈血4mL，即時分離血清，分兩管，-70℃凍存，分別用于細胞因子和miRNA-146a的檢測。

1.3 實驗儀器及試劑

IL-17A和 IFN-γ試劑盒（BD公司），核酸提取試劑盒（碩世生物科技有限公司），RevertAid First Strand cDNA synthesis kit（Thermo公司），SYBR Green熒光定量 PCR檢測試劑盒（TaKaRa公司），miRNA-146a檢測引物（廣州市銳博生物科技有限公司），FACSCalibur流式細胞儀（BD公司），實時熒光定量PCR儀（ABI 7500）。

1.4 IL-17A和 IFN-γ的測定

嚴格按照 BD公司提供的 BDTMCytometric Bead Array（CBA）Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit說明書操作。

1.5 miRNA-146a的檢測

①血清總RNA的提取按說明書進行，獲純化的核酸溶液-80℃保存備用。②逆轉錄按照Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的miRNA逆轉錄反應使用說明書進行操作。首先將總RNA作適當的濃度調整，然后選擇25 μL反應體系在去RNA酶的 PCR管中進行反應體系的配置，包括 5×逆轉錄緩沖液，dNTP混合液，RNA酶抑制劑，逆轉錄酶，無 RNA酶水。將反應體系混勻后 42℃60 min，70℃ 10 min。③定量 PCR檢測按照 Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的 miRNA qPCR使用說明書進行操作。選擇 20 μL反應體系，包括SYBR Green Mix，miRNA第1鏈 cDNA，上、下游引物，無RNA酶水。循環參數:94℃預變性2 min，94 ℃20 s，60℃34 s，共循環 40次，以 U6作為內參。miR-146a相對表達以2-△CT表示。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。實驗數據以均數 ±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t檢驗和相關性分析；以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清 IL-17A、IFN-γ及 miRNA-146a表達水平的比較

HT組患者 IL-17A，IFN-γ水平均較對照組明顯升高，差異有統計學意義；HT組 miRNA-146a水平明顯低于對照組，見表1。

表1 兩組血清IL-17A，IFN-γ及miRNA-146a水平的比較

2.2 miRNA-146a表達水平與 IL-17A、IFN-γ的相關性

相關性分析結果顯示，HT患者 IL-17A與IFN-γ表達有相關性（r=0.307，P=0.015）。而miRNA-146a與IL-17A（r=-0.059，P=0.648）、IFN-γ（r= -0.218，P=0.089）之間均無明顯相關關系。

3 討論

HT是自身免疫性甲狀腺病的一種，是一種器官特異性免疫疾病，在患者血清中可檢測出高效價的自身抗體。如不進行積極的治療，一般都會發展成甲狀腺功能減退而導致終生服用激素。

Th17細胞以及其產生的IL-17參與了類風濕關節炎、多發性硬化癥等自身免疫性疾病的發病［5-6］。文獻報道Th17在自身免疫性甲狀腺病中較正常組升高［7］。Th17細胞主要分泌細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22等，以分泌 IL-17A為主要特征。其為強烈的促炎因子，介導自身免疫性疾病的發展。本實驗檢測了 HT患者血清 IL-17A的表達情況，結果顯示HT患者較對照組明顯增高，這與陳紫君等［8］研究結果相符合。其機制可能是 IL-17A強烈的促炎性作用導致濾泡上皮細胞破壞萎縮，導致甲狀腺自身免疫功能紊亂，最終導致了 HT的發生。Caturegli等［9］研究發現高水平的 IFN-γ會抑制甲狀腺細胞的鈉碘同向轉運，導致小鼠甲狀腺結構嚴重破壞，甲狀腺功能障礙，同時向易感小鼠的甲狀腺內注射IFN-γ會誘導發生甲狀腺炎。本組 HT患者血清 IFN-γ較對照組明顯增高，這與文獻報道相符［10］。文獻還表明［11］，HT患者外周血 Th1、Th2、Th17和 Treg均呈高表達，而Th1、Th2和 Th17又分泌高水平的 IL-4、IL-17A和 IFN-γ。這些觀點與結論與本文的研究結果基本一致。

miRNA可通過調節免疫細胞的分化、信號轉導、免疫應答等多個層面對免疫反應執行較為柔和和精細的微調［12］，且人類血清中的 miRNA參與了自身免疫性甲狀腺炎的發生與發展［2-3］，文獻表明miRNA-146a在 HT的發病中發揮作用［4］。本研究結果顯示，HT患者血清 miRNA-146a表達水平與健康對照組比較明顯下調，與 IL-17A和 IFN-γ表達水平并無顯著相關關系。我們通過 miRNA與靶基因的預測軟件分析，也進一步證實 IL-17A和 IFN-γ也確實非miR-146a作用的靶基因。與我們的研究結果一致，Bernecker等［13］提出 miRNA-146a在 HT患者血清中表現為下調。

綜上所述，IL-17A和 IFN-γ在 HT患者血清中均呈表高達，而miRNA-146a低表達，提示三者均可能參與了HT的發病進程，對 HT的診斷可起到一定的參考價值。但是，在發病機制上，IL-17A與 IFN-γ之間存在一定的相關性，但 miRNA-146A與前兩者并無直接的相關性。

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R581.4

B

1671-7783（2015）01-0072-02

10.13312/j.issn.1671-7783.y140247

*:通訊作者，副教授，碩士生導師，E-mail:xiaochun@ujs.edu.cn

2014-09-17 ［編輯］何承志