靛玉紅吲哚-3-取代物對肝癌 HepG2細胞生物學行為的影響及其機制

談德斐，郭文潔，夏娟，管廷尉，高靜，姚其正（.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江03；.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京0009）

靛玉紅吲哚-3-取代物對肝癌 HepG2細胞生物學行為的影響及其機制

談德斐1，郭文潔1，夏娟1，管廷尉1，高靜1，姚其正2
（1.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江212013；2.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京210009）

目的：研究新合成的靛玉紅衍生物吲哚-3-取代物A的體外抗腫瘤作用及可能機制。方法：以不同濃度的吲哚-3-取代物 A作用于 HepG2細胞，MTT法檢測細胞活力；觀察 HepG2細胞的集落形成；DAPI染色觀察細胞核的變化；Annexin-V/PI雙染檢測細胞凋亡率；分別采用 JC-1和 Fluo-3/AM染色檢測 HepG2細胞線粒體膜電位和胞內 Ca2+含量；蛋白質印跡檢測 Bcl-2、Bax的表達和 Caspase-3、9的活化。結果：吲哚-3-取代物 A對 HepG2細胞的抑制作用呈時間濃度依賴性，且可抑制HepG2細胞克隆集落的形成。吲哚-3-取代物 A作用于 HepG2細胞后，細胞表現出明顯的核固縮、碎裂等凋亡特征，Annexin-V/PI雙染結果顯示 HepG2細胞出現明顯的凋亡，細胞凋亡相關的 Caspase-3、9活化也明顯增加。同時，吲哚-3-取代物 A處理可降低 Bcl-2的蛋白表達水平，提高 Bax的蛋白表達水平，呈濃度依賴性。此外，吲哚-3-取代物A能降低線粒體膜電位并誘發細胞內鈣離子超載。結論：吲哚-3-取代物 A能夠誘導 HepG2細胞出現明顯的細胞凋亡，其機制可能與損傷線粒體，活化線粒體介導的細胞凋亡通路密切相關。

靛玉紅吲哚-3-取代物；抗腫瘤；細胞凋亡；線粒體

［Abstract］Objective:To investigate the anti-tumor effects and possible mechanisms of a novel indole-3-derivate indirubin in vitro.Methods:Human HepG2 cells were exposed to different concentrations of indole-3-derivate A，cell proliferation was detected by MTT assay and cell colony formation of HepG2 cells treated with indole-3-derivate A was also observed.Then the nuclei changes were observed by staining with DAPI and cell apoptosis was detected by Annexin-V/PI staining.Meanwhile，mitochondrial membrane potential and intracellular free Ca2+content were detected with JC-1and Fluo-3/AM staining，respectively. Moreover，the protein levels of Bcl-2，Bax and activation of Caspase-3，9 were examined by western blotting.Results:Indole-3-derivate A inhibited the proliferation and colony formation of HepG2 cells in a doseand time-dependent way.Besides that，it was found that nucleus morphology was showing pyknosis and fragmentation and early apoptotic cells were significantly increased by Annexin-V/PI staining after indole-3-derivate A treatment.Moreover，western blotting showed indole-3-derivate A activated Caspase-3，9，decreased the expression of Bcl-2 and increased the expression of Bax in a dose-dependent manner.In addition，indole-3-derivate A caused a loss of mitochondrial membrane potential and intracellular Ca2+overloading.Conclusions:Indole-3-derivate A could significantly inhibit proliferation of HepG2 cells and the mechanisms might be related to mitochondria dysfunction and activation of mitochondria-dependent apoptotic pathway.

［Key words］indole-3-derivate indirubin；antitumor；apoptosis；mitochondria

肝癌致死率占世界癌癥相關死亡的第3位［1］。而且，僅有10％～25％的肝癌患者適合手術治療［2］，且仍有復發的風險。因此，研發治療肝癌的特異性藥物勢在必行。國內研究發現，當歸龍薈丸對治療慢性粒細胞白血病具有明顯療效，其中的中藥青黛是抗腫瘤的有效成分［3］，而靛藍和靛玉紅又是青黛的主要成分。靛玉紅對慢性粒細胞白血病具有明顯的抑制作用，且臨床療效可靠、毒副反應小、對骨髓無明顯抑制，是一種有效低毒的抗癌藥物［4］；但因其溶解性較差，所以臨床應用受到一定限制。近年來，人們不斷地認識和研究靛玉紅的藥理作用機制，其結構修飾和應用范圍也不斷地得到擴展［5-8］。因此，為了克服靛玉紅溶解性較差及效果不夠強等缺陷，中國藥科大學姚其正教授課題組設計合成了一系列新的靛玉紅類化合物。前期實驗對這類化合物進行篩選［9］，發現吲哚-3-取代物 A具有良好的體外抗腫瘤活性和體內抗腫瘤作用，但其體外抗腫瘤作用的機制還不明確。故本實驗擬對吲哚-3-取代物 A的體外抗腫瘤的作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

吲哚-3-取代物 A（靛玉紅衍生物中篩選得到，純度 ＞98％）由中國藥科大學藥學院姚其正教授課題組合成；MTT（Amresco公司）；JC-1，Fluo-3/AM和Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒（Molecular Probes公司）；兔抗人Bax抗體，兔抗人Caspase-9抗體和鼠抗人 Caspase-3抗體均購自 Abcam公司；鼠抗人 Bcl-2抗體和鼠抗人GAPDH抗體（Santa Cruz公司）；羊抗鼠抗體和羊抗兔抗體購自博士德公司；DAPI和 ECL化學發光液購自碧云天生物工程公司；其余未特殊注明的試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養

人肝癌細胞（HepG2）由南京大學徐力致老師惠贈，培養于含10％滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素（各 100萬 U/L）的 DMEM（Gibco公司）培養液中，置于 37℃，含5％CO2的飽和濕度培養箱中培養。

1.3 MTT法檢測細胞活力

取對數生長期的 HepG2細胞，消化、計數，以4×104/mL的密度接種于96孔培養板中，每孔100 μL。培養24 h后，以2、4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物A處理細胞。給藥組每個濃度設5個復孔，以含0.4％DMSO的培養液作為對照組。藥物分別作用細胞12、24、36、48 h后，去上清，每孔加入100 μL MTT（1 mg/mL），繼續培養4h，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩混勻，用酶標儀測定光密度值［D（570 nm）］計算細胞活力。細胞活力（％）=（給藥組D值/對照組D值）×100％。

1.4 集落形成分析

取對數生長期的 HepG2細胞（5 000個細胞/孔）接種于24孔培養板中，接種4 h后，給予4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物 A處理細胞，孵育 7 d，然后觀察集落的形成情況。用 4％低聚甲醛固定10 min，并用0.5％結晶紫染色10 min，然后流水沖洗4次，晾干，拍照。

1.5 DAPI染色檢測細胞核形態

取對數生長期的 HepG2細胞，消化、計數，以4×104/mL的密度接種于24孔培養板中，每孔500 μL。培養24 h后，以2、4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物A處理腫瘤細胞48 h，棄培養基，PBS洗2遍，4％低聚甲醛室溫固定細胞15 min。加入 DAPI染色液室溫避光孵育10 min，棄染液，PBS洗2遍，熒光顯微鏡觀察細胞核的變化。

1.6 Annexin-V/PI雙染色法檢測細胞凋亡

以 2、4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物 A處理HepG2細胞48 h后，收集1×106細胞，預冷 PBS洗2遍，加入400 μL結合緩沖液，輕輕混勻細胞，加入5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI溶液，避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 JC-1染色檢測線粒體膜電位

取對數生長期的 HepG2細胞，消化、計數，以每孔4×103個細胞接種于24孔培養板或96孔熒光酶標板培養，以2、4、8、16 μmol/L吲哚-3-取代物 A分別作用于HepG2細胞12、24、36、48 h后，棄培養基，加入2.5 μg/mL JC-1染色工作液，37℃負載探針40 min，PBS洗2次。用倒置熒光顯微鏡和熒光酶標儀于激發光波長488 nm，發射光波長525/590 nm觀察檢測線粒體膜電位的變化。

1.8 Fluo-3/AM檢測細胞內鈣離子濃度

以2、4、8、16 μmol/L的吲哚-3-取代物 A處理HepG2細胞 24 h后，收集1×106細胞，PBS洗 2次；加入1 mL PBS重懸細胞，再加3～4 μL Fluo-3染料（1 μg/μL）混勻；37℃避光孵育10 min；然后1 000r/min離心5 min，PBS洗2遍；棄上清，加0.3 mL PBS重懸細胞。流式細胞儀分析104個細胞Fluo-3染色后的平均熒光強度，作為評定細胞內 Ca2+濃度的指標。測定條件為激發波長488 nm，發射波長525 nm。

1.9 蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達

以4、8、16 μmol/L的吲哚-3-取代物 A處理HepG2細胞24 h，加入細胞全蛋白裂解液裂解細胞收集蛋白樣品。110 V恒壓電泳 80 min；300 mA恒流濕法轉膜90 min；將膜置于封閉液中封閉1 h，TBST洗1次；加入一抗稀釋液（抗 Caspase-3、抗Caspase-9、抗Bcl-2、抗Bax、抗GAPDH，1∶1 000），4℃孵育過夜；TBST洗6次，每次10 min；將膜置于二抗稀釋液中（1∶2 000），室溫孵育1 h；TBST洗6次，每次10 min；吸水紙吸干膜上水分，加 ECL發光液顯色，于暗室內曝光合適時間得到目的條帶，掃描圖像并分析結果。

1.10 定量和統計分析

2 結果

2.1 吲哚-3-取代物 A對 HepG2細胞增殖的影響

以不同濃度的吲哚-3-取代物 A分別作用于HepG2細胞12、24、36、48 h，MTT結果顯示（圖1），吲哚-3-取代物 A抑制 HepG2細胞的增殖，且呈時間-濃度依賴性，在16 μmol/L處理48 h時，抑制率達到81.1％。隨后用倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長狀況（圖2），吲哚-3-取代物 A引起細胞形態發生較明顯的變化，細胞皺縮，變圓，數量明顯減少，說明吲哚-3-取代物 A能明顯抑制腫瘤細胞增殖，與MTT結果一致。

圖1 不同濃度吲哚-3-取代物 A對細胞增殖力的影響

2.2 吲哚-3-取代物A對HepG2細胞集落形成的影響

利用克隆集落形成法測量單個細胞增殖為克隆集落的能力。如圖3所示，吲哚-3-取代物 A能夠抑制HepG2細胞的克隆生成，且呈濃度依賴性；與對照組比較，16 μmol/L吲哚-3-取代物 A處理組細胞克隆形成明顯減少。由此表明，吲哚-3-取代物A處理能夠抑制 HepG2細胞的克隆生成。

圖2 吲哚-3-取代物 A作用48 h后對 HepG2細胞形態的影響（倒置相差顯微鏡 ×200）

圖3 不同濃度吲哚-3-取代物A處理后細胞的集落形成

2.3 吲哚-3-取代物 A對 HepG2細胞凋亡的影響

DAPI染色觀察吲哚-3-取代物A作用后HepG2細胞核的變化，如圖4A所示，吲哚-3-取代物 A能夠使HepG2細胞的染色質固縮。同時，采用Annexin-V-FITC和 PI雙染檢測吲哚-3-取代物 A能否誘導HepG2細胞發生凋亡。如圖 4B所示，用 8 μmol/L 和16 μmol/L吲哚-3-取代物A處理HepG2細胞后，分別有20.68％和51.47％的細胞出現早期凋亡，表明吲哚-3-取代物 A可誘導 HepG2細胞凋亡，且呈濃度依賴性。

2.4 吲哚-3-取代物A誘導HepG2細胞發生Caspases依賴性的凋亡

流式細胞儀檢測發現，吲哚-3-取代物A處理細胞后，凋亡早期細胞數明顯增加。對 Caspase-3，9的表達及活化進行檢測，結果顯示，吲哚-3-取代物A可激活Caspase-3，9前體的裂解，呈濃度依賴性；吲哚-3-取代物 A誘導 HepG2細胞凋亡涉及內源性凋亡信號通路。同時，隨著化合物給藥濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低，促凋亡蛋白Bax的表達水平增高。見圖5。

圖4 吲哚-3-取代物 A對 HepG2細胞凋亡的影響

圖5 吲哚-3-取代物A對凋亡與抗凋亡蛋白表達的影響

2.5 吲哚-3-取代物A對HepG2細胞線粒體膜電位的影響

隨著吲哚-3-取代物 A濃度的增加，HepG2細胞的線粒體膜電位呈濃度依賴性下降。同時，熒光酶標儀測定結果顯示，不同濃度吲哚-3-取代物 A給藥處理12 h對線粒體膜電位沒有影響，而處理24 h后細胞線粒體膜電位下降，隨著濃度的升高及處理時間的增加，細胞線粒體膜電位減弱得越明顯。見圖6。對照組JC-1呈聚合體形式存在于細胞內，說明線粒體膜電位較高。相比對照組，不同濃度吲哚-3-取代物A處理48 h后，JC-1單體形式逐漸增多，線粒體膜電位下降，尤其16 μmol/L化合物處理時線粒體膜電位下降明顯。見圖 7。以上結果表明，吲哚-3-取代物 A可誘導線粒體膜電位呈時間濃度依賴性下降。

圖6 不同濃度吲哚-3-取代物 A作用不同時間后HepG2細胞線粒體膜電位的變化

2.6 吲哚-3-取代物A對 HepG2細胞內 Ca2+濃度的影響

圖7 吲哚-3-取代物A作用48 h后對線粒體膜電位的影響（200×）

流式細胞術檢測結果顯示，2 μmol/L處理時細胞熒光強度略有增強，圖中主峰明顯右移，與對照組比較，吲哚-3-取代物 A處理組平均熒光強度升高，說明吲哚-3-取代物A可以誘導細胞內Ca2+超載，Ca2+的熒光強度隨著吲哚-3-取代物 A作用濃度的增加而增強。見圖8。

圖8 吲哚-3-取代物 A對 HepG2細胞內 Ca2+的影響

3 討論

本課題組前期的研究顯示，吲哚-3-取代物A作用于HepG2細胞后，通過下調cdc 2和cyclin B1的表達，從而誘導細胞周期阻滯于 G2/M期［9］。此結論與Hoessel等［10］的研究報道一致，證實吲哚-3-取代物A與靛玉紅一樣具有阻滯細胞周期的作用。本文就吲哚-3-取代物A對HepG2細胞的作用及誘導細胞凋亡的方式及可能機制進行了進一步的探索。結果顯示，吲哚-3-取代物 A對HepG2細胞的抑制作用呈時間 濃度依賴性，且可抑制HepG2細胞克隆集落的形成。多項研究表明靛玉紅類化合物能夠誘導腫瘤細胞凋亡［11-12］。本實驗中我們發現吲哚-3-取代物 A同樣可以誘導 HepG2細胞發生早期凋亡。Caspases家族蛋白是凋亡過程中涉及的蛋白水解系統中的主要蛋白酶成分，在促凋亡信號的促發下引起酶降解的級聯反應。根據結構和功能的區別，Caspases家族蛋白可分為2類:起始Caspases （Caspase-2，8，9，10）和執行 Caspases（Caspase-3，6，7）。對于線粒體介導的凋亡通路而言，由于線粒體膜的完整性遭到破壞導致線粒體膜電位降低，細胞色素C釋放，Caspase-9激活。活化的 Caspase-9進而剪切凋亡執行蛋白Caspase-3和Caspase-7，最終導致染色質固縮，DNA片段化以及凋亡小體的形成。因此，在本實驗中，我們觀察到吲哚-3-取代物A通過濃度依賴性激活 Caspase-3，9前體的裂解從而誘導 HepG2細胞發生早期凋亡。Berger等［11］同時發現，靛玉紅類衍生物能敏化黑色素瘤細胞的死亡配體從而介導細胞發生外源性凋亡，因此，我們將在以后的實驗中進一步研究吲哚-3-取代物 A誘導細胞凋亡是否同樣涉及外源性凋亡通路，并進一步探索其作用機制。除此之外，我們還對線粒體的功能進行檢測，發現吲哚-3-取代物A呈時間度依賴性地降低線粒體膜電位，誘導 Ca2+超載。再者，我們還考慮到對線粒體凋亡通路的調節是一個復雜的，多重因素共同作用的結果。而 Bcl-2家族蛋白恰好在該過程中起重要作用，Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，其激活與腫瘤的生長，侵襲，轉移等密切相關［2］。因此，我們在實驗中觀察吲哚-3-取代物A誘導細胞凋亡的過程中是否涉及到 Bcl-2家族蛋白的變化。實驗結果表明，吲哚-3-取代物A可誘導Bcl-2的表達呈濃度依賴性降低，促凋亡蛋白 Bax的表達呈濃度依賴性增高，通過降低Bcl-2/Bax的比率誘導細胞凋亡。對于 Bcl-2家族蛋白在吲哚-3-取代物A誘導的細胞凋亡過程中的作用機制尚需進一步研究。

本實驗探索了新合成的靛玉紅類衍生物的體外抗腫瘤作用的機制，發現其具有一定的潛在應用價值，為開發擁有自主知識產權的這一類新藥積累了實驗數據。

［1］Clavien PA，Lesurtel M，Bossuyt PM，et al.Recommendations for liver transplantation for hepatocellular carcinoma:an international consensus conference report ［J］.Lancet Oncol，2012，13（1）:e11-e22.

［2］Xu YZ，Zheng RL，Zhou Y，et al.Small molecular anticancer agent SKLB703 induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells via the mitochondrial apoptotic pathway invitro and inhibits tumor growth invivo ［J］.Cancer Lett，2011，313（1）:44-53.

［3］吳蓮明，楊堯平，朱傳先，等.青黛治療慢性粒細胞白血病有效成分的研究（I）［J］.中草藥通訊，1978（4）: 6-8.

［4］萬景華，尤育初，糜靜嫻，等.靛玉紅對正常造血細胞生成的影響［J］.中國藥理學報，1981，2（4）:241-244.

［5］Braig S，Kressirer CA，Liebl J，et al.Indirubin derivative 6BIO suppresses metastasis［J］.Cancer Res，2013，73（19）:6004-6012.

［6］Nam S，Wen W，Schroeder A，et al.Dual inhibition of Janus and Src family kinases by novel indirubin derivative blocks constitutively-activated Stat3 signaling associated with apoptosis of human pancreatic cancer cells ［J］.Mol Oncol，2013，7（3）:369-378.

［7］Heshmati N，Wagner B，Cheng X，et al.Physicochemical characterization and in vitro permeation of an indirubin derivative［J］.Eur J Pharm Sci，2013，50（3/4）: 467-475.

［8］Liu L，Kritsanida M，Magiatis P，et al.A novel 7-bromoindirubin with potent anticancer activity suppresses survival of human melanoma cells associated with inhibition of STAT3 and Akt signaling［J］.Cancer Biol Ther，2012，13（13）:1255-1261.

［9］Liang C，Xia J，Lei D，et al.Synthesis，in vitro and in vivo antitumor activity of symmetrical bis-Schiff base derivatives of isatin［J］.Eur J Med Chem，2014，74:742 -750.

［10］Hoessel R，Leclerc S，Endicott JA，et al.Indirubin， the active constituent of a Chinese antileukaemia medicine，inhibits cyclin-dependent kinases［J］.Nat Cell Biol，1999，1（1）:60-67.

［11］Berger A，Quast SA，Pl?tz M，et al.Sensitization of melanoma cells for death ligand-induced apoptosis by an indirubin derivative Enhancement of both extrinsic and intrinsic apoptosis pathways［J］.Biochem Pharmacol，2011，81（1）:71-81.

［12］Merz KH，Schwahn S，Hippe F，et al.Novel indirubin derivatives，promising antitumor agents inhibiting cyclindependent kinases［J］.Int J Clin Pharmacol Ther，2004，42（11）:656-658.

Effect of a novel indole-3-derivate indirubin on human HepG2 cells and underlying mechanism

TAN De-fei1，GUO Wen-jie1，XIA Juan1，GUAN Ting-wei1，GAO Jing1，YAO Qi-zheng2
（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing Jiangsu 210009，China）

R749.16

A

1671-7783（2015）01-0038-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140246

談德斐（1987—），女，碩士研究生；高靜（通訊作者），教授，博士，E-mail:jinggao@ujs.edu.cn

2014-09-17 ［編輯］劉星星