ZIC1在結直腸癌中的表達及其對結腸癌細胞增殖能力的影響

王杰鋒，李鵬飛，曹方，陸偉杰，丁厚中（.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 03；.江蘇大學附屬昆山醫院綜合外科，江蘇 昆山 5300）

ZIC1在結直腸癌中的表達及其對結腸癌細胞增殖能力的影響

王杰鋒1，李鵬飛1，曹方2，陸偉杰2，丁厚中2
（1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學附屬昆山醫院綜合外科，江蘇 昆山 215300）

目的：研究結直腸癌組織中小腦鋅指結構1（zinc finger of the cerebellum 1，ZIC1）基因的表達及其對結腸癌HCT-8細胞增殖能力的影響。方法：構建192例結直腸癌組織芯片，免疫組織化學法檢測結直腸癌組織及相應癌旁組織中ZIC1的表達，分析其表達與臨床病理參數之間的關系；構建 pcDNA3.1-ZIC1表達載體（實驗組）和 pcDNA3.1空載體組（陰性對照組），轉染結腸癌 HCT-8細胞，蛋白質印跡和 RT-PCR法檢測實驗組、陰性對照組和空白對照組（常規無轉染培養）細胞 ZIC1的表達水平，MTT法檢測 3組細胞增殖能力的變化。結果：結直腸癌組織中 ZIC1的陽性表達率（41.1％）明顯低于癌旁組織（68.8％，χ2=29.550，P=0.000）；ZIC1的表達與Dukes分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移相關（P均＜0.05），而與年齡、性別無關（P＞0.05）。RT-PCR及蛋白質印跡檢測結果顯示，實驗組細胞 ZIC1的表達明顯高于陰性對照組及空白對照組；MTT法檢測結果顯示，實驗組 HCT-8細胞增殖能力明顯下降。結論:ZIC1基因可能參與了結直腸癌的發生、發展。

小腦鋅指結構1；結直腸癌；免疫組織化學；蛋白質印跡

［Abstract］Objective:To investigate the expression of zinc finger of the cerebellum 1（ZIC1）gene in the colorectal cancer tissue and its impact on the proliferation of colon cancer HCT-8 cells.Methods:Tissue microarray blocks containing 192 colorectal cancer tumor specimens were conducted.Expression of ZIC1 in colorectal cancer tumor specimens and adjacent cancer tissues was analyzed using immunohistochemistry；the relationship between ZIC1 expression and clinical pathological parameters was analysed.The pcDNA3.1-ZIC1 expression vector（experiment group）and pcDNA3.1 empty carrier group（negative control group）were constructed to transfect HCT-8 cells，Western blotting and RT-PCR were used to detect ZIC1 expression among the experiment group，negative control group and blank control group（no transfection cultivation）.The changes of cells proliferation of three groups were determined by MTT.Results:The positive expression rate of ZIC1 in colorectal cancer tissue was higher than adjacent cancer tissues（41.1％ vs 68.8％，P＜0.05）.The ZIC1 expression in colorectal cancer tissues was correlated with Dukes staging，degree of differentiation，infiltration depth and lymph node metastasis（P＜0.05），whereas incorrelated with age and gender（P＞0.05）.RT-PCR and Western blotting showed the expression of ZIC1 in experiment group was significantly higher than that in negative control group and blank control group；MTT showed the cell proliferation in experiment group reduced markedly.Conclusion:ZIC1 might participate in the development and progression of colorectal cancer.

［Key words］zinc finger of the cerebellum 1；colorectal cancer；immunohistochemistry；Western blotting

結直腸癌發病率目前占全球惡性腫瘤第 3位，病死率居第4位，Ⅰ期5年生存率（＞90％）明顯高于Ⅳ期（10％）［1］，早期診斷和治療仍是提高患者生存率的關鍵。小腦鋅指結構1（zinc finger of the cerebellum 1，ZIC1）基因是 Aruga等［2］于1994年在成年鼠小腦中首次發現，其編碼鋅指結構蛋白。研究報道ZIC1與多種腫瘤的發生、發展密切相關，如髓母細胞瘤［3］、卵巢腫瘤［4］、間質腫瘤［5］、子宮內膜癌［6］、胃癌［7］和甲狀腺癌［8］等。本研究旨在探討ZIC1在結直腸癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系，以及轉染ZIC1對結腸癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養

結腸癌HCT-8細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞采用含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的完全培養基，置于 37℃、5％CO2恒溫箱中培養；待細胞鋪滿培養皿70％～80％時，0.25％胰蛋白酶消化，選取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 臨床標本

收集2003年1月至 2010年12月于江蘇大學附屬昆山醫院行結直腸癌根治術192例患者臨床資料。其中，男116例，女76例，年齡39～76歲，中位年齡60歲；術中取結直腸癌組織和癌旁相對正常的2處組織標本，手術標本均經 2名以上病理科醫師確認，高分化34例，中分化75例，低分化83例；浸潤深度:漿膜內33例，漿膜外159例；Dukes分期:A +B期65例、C+D期127例；無淋巴結轉移70例，有淋巴結轉移122例。經病理證實沒有癌細胞的相對正常組織為癌旁組織。所有患者均無腸癌家族遺傳史，術前均未接受過放化療。

1.3 組織芯片制備

根據 HE切片選取存檔的結直腸癌組織蠟塊，用組織芯片制作儀在空白受體蠟塊上打孔，再用組織取樣針從192例標本的取樣位點上取組織蠟芯，依次有序地移入受體蠟塊中，制作成組織芯片蠟塊。最后石蠟切片機連續切片，厚4 μm。在距離腫塊邊緣2 cm以上取正常黏膜組織作為癌旁組織，每個病例均含有1個原發灶腫瘤組織和1個癌旁組織，通過組織芯片構建儀制成芯片。

1.4 免疫組織化學檢測 ZIC1蛋白的表達

利用構建的組織芯片，按照SP免疫組織化學試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固；ZIC1羊抗人單克隆抗體稀釋度為1∶100，PBS代替一抗作為陰性對照。結果判斷采用陽性細胞數評分與陽性信號評分相結合的方法［9］，高倍鏡視野下觀察組織切片，每張切片均在 5個視野下進行陽性細胞計數。陽性細胞數評分即根據陽性細胞所占的5個以上高倍鏡視野比例計數:陽性細胞數＜5％為0分，5％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％計 3分，＞75％為 4分。陽性信號評分:淡黃色為1分，黃色或深黃色為 2分，褐色或棕褐色為3分。上述陽性細胞數評分和陽性信號評分相乘≥1分為陽性，＜1為陰性。

1.5 質粒的擴增與抽提

含ZIC1基因的重組質粒大腸埃希菌購于上海吉凱公司。吸取大腸埃希菌液 20～40 μL、LB培養基3 mL、卡那霉素5 μL（5 μg/mL），37℃300 r/min恒溫培養，搖床搖菌過夜（12～16 h）；室溫12 000 r/ min，離心1 min，棄上清液；按照質粒提取試劑說明書逐步操作，紫外分光光度計定量其質量及純度，提取的質粒于4℃短期保存（-70℃長期保存）。

1.6 質粒轉染

將結腸癌HCT-8細胞隨機分為實驗組（轉染pcDNA3.1-ZIC1質粒），陰性對照組（轉染 pcDNA 3.1空質粒）和空白對照組（常規無轉染培養），以（1～2）×105/孔的密度接種于 6孔板中，待細胞生長至85％～90％時，按試劑盒要求將 pcDNA3.1-ZIC1質粒及 pcDNA3.1空質粒與脂質體混合后加入 6孔板中；輕微混勻，置于 37℃孵箱中培養；轉染4～6 h，加入完全 DMEM繼續培養；24 h消化傳代，部分用于mRNA和蛋白檢測，部分用于細胞增殖。

1.7 反轉錄 PCR檢測 ZIC1 mRNA的轉錄水平

基因組RNA抽提試劑盒購自BioTeKe公司，TaKaRa Ex TaqTMPCR及反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司。通過 miRBase及基因庫查找基因序列，Primer 5.0軟件進行相關引物設計。ZIC1引物序列:上游，5′-AAACTGGTTAACCACATCCGC-3′，下游，5′-CTCAAACTCGCACTTGAAGG-3′；內參照物GAPDH引物序列:上游，5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游，5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，引物由上海吉凱基因公司合成。PCR反應條件: 95℃預變性30 s，再行94℃30 s、60℃ 30 s、72℃90 s，共 30個循環，最后 72℃延伸10 min，4℃保存。產物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，Quantity-One圖像處理軟件行灰度分析，比較空白對照組、陰性對照組及實驗組結腸癌 HCT-8細胞 ZIC1 mRNA的表達情況。

1.8 蛋白質印跡檢測 ZIC1蛋白的表達

HCT-8細胞轉染48 h后，PBS沖洗，加入300 μL蛋白裂解液，冰上裂解10 min，然后移入1.5 mL EP管，4℃ 12 000 r/min離心 30 min，取上清，BCA法行蛋白定量。10.5％SDS-PAGE分離蛋白樣品，250 mA電轉移2 h至硝酸纖維素膜；5％脫脂奶粉封閉1 h；加入 ZIC1一抗（1∶1 000），4℃過夜；TBST洗膜后，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h；洗膜3次，ECL顯色。采用 GADPH（1∶5 000）為內參。實驗組、陰性對照組及空白對照組 ZIC1相對表達量為其條帶光密度與 GADPH的比值。

1.9 MTT法檢測細胞增殖

HCT-8細胞轉染 pcDNA3.1-ZIC1 24 h后，胰酶消化計數；按每孔1×104個細胞接種于96孔培養板，設為實驗組，將同等條件下的 pcDNA3.1空載體設為陰性對照組，未轉染pcDNA3.1-ZIC1設為空白對照組；每組設6個復孔，于 37℃、5％CO2孵箱中培養，分別檢測24、48、72 h細胞的增殖情況。MTT法檢測具體步驟如下:每孔加入 MTT 10 μL（5 mg/mL），孵育4 h；棄培養液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min；酶聯免疫儀測定 492 nm波長處光密度（D）值，取6孔平均值，以時間為橫坐標，D值為縱坐標繪圖。

1.10 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計數資料采用配對 χ2檢驗，計量資料的多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用 LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZIC1蛋白在結直腸癌和癌旁組織中的表達

ZIC1蛋白陽性表達呈淡黃色至棕黃色，在結直腸癌中的陽性表達率為41.1％（79/192），明顯低于癌旁正常組織（68.8％，132/192），差異有統計學意義χ2=29.550，P=0.000）。見圖1。

2.2 ZIC1蛋白表達與臨床病理參數之間的關系

統計學分析結果顯示，結直腸癌組織中ZIC1蛋白表達與浸潤深度、分化程度、Dukes分期及淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與年齡和性別無關（P＞0.05），見表1。

2.3 腸癌細胞質粒轉染前后 ZIC1的表達量

蛋白質印跡結果顯示，實驗組 ZIC1的表達較空白對照組、陰性對照組增強，與 RT-PCR顯示的實驗組 ZIC1 mRNA增高的結果一致。見圖2，圖3。

圖1 結直腸癌組織和癌旁組織中 ZIC1蛋白的表達（免疫組織化學 ×400）

表1 ZIC1蛋白表達與臨床病理參數間的關系

圖2 各組細胞 ZIC1蛋白的表達

圖3 各組細胞 ZIC1 mRNA的表達

2.4 HCT-8細胞增殖能力的變化

MTT法檢測結果顯示，3組HCT-8細胞24、48 h D值差異無統計學意義（F24 h=1.661，P=0.223；F48 h=0.763，P=0.484）；72 h D值差異有統計學意義（F=732.642，P=0.000）。進一步兩兩比較，實驗組 D值明顯低于與空白對照組和陰性對照組P=0.000），而空白對照組與陰性對照組間D值差異無統計學意義（P=0.098），提示實驗組 HCT-8細胞的增殖能力在72 h時明顯下降，見圖4。

圖4各組 HCT-8細胞增殖力的比較

3 討論

ZIC1是 Aruga等［2］在1994年篩選小腦富含的cDNA中最先發現并克隆得到，位于3q24，具有3個外顯子結構和C2H2型鋅指區域，轉錄產物為重要的C末端鋅指轉錄因子，可結合一些富含 GC序列的靶基因并形成共同作用的“復合體”，從而影響靶基因的轉錄過程。文獻報道，ZICl與神經系統發育中細胞增殖和分化［2，10-11］密切相關，Aruga［11］認為ZIC1過表達可促進小鼠顆粒神經元細胞的增殖。ZIC1的異常表達與多種腫瘤密切相關。Pourebrahim等［12］研究顯示，ZIC1和ZIC4在硬纖維瘤，Dupuytren′s病和肥大性瘢痕中高表達，而在正常組織中不表達。ZIC1蛋白在脂肪肉瘤中的表達明顯高于脂肪瘤和正常脂肪組織［5，13］，而在其他腫瘤如卵巢腫瘤［4］、子宮內膜癌［6］、胃癌［7］、甲狀 腺癌［8］中 呈低表達，此表達差異的機制目前尚不清楚。亦有研究表明，ZIC1與腫瘤的惡性生物學行為密切相關，如 Wang等［7］發現 ZIC1過表達可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其可能與 Shh信號通路有關。近來，Qiang等［8］研究表明，ZIC1可能通過阻斷 PI3K/ Akt和 MAPK信號通路及增強轉錄因子 FOXO3a的轉錄從而介導甲狀腺癌細胞周期阻滯和細胞凋亡，與 Zhong等［14］的結論一致，即在胃癌中 ZIC1過表達可導致Shh，PI3K和MAPK信號通路失活。

此外，關于ZIC1與結直腸癌的關系 Gan等［15］有類似研究，其通過分析 40例結直腸癌患者中ZIC1基因的表達發現，ZIC1在結直腸癌中呈低表達，其機制可能與基因啟動子甲基化相關。由于ZIC1在不同的腫瘤組織中表達各異，且Gan等的研究例數較少，因此本研究通過擴大病例數進一步驗證了ZIC1在結直腸癌中的表達及其對結腸癌細胞增殖的影響。

本研究結果顯示，結直腸癌組織中 ZIC1的陽性表達率明顯低于癌旁正常組織；此外，ZIC1的低表達與Dukes分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與年齡、性別無關，說明 ZIC1的低表達與結直腸癌的惡性生物學行為密切相關。

為進一步驗證 ZIC1在結直腸癌發生過程中的作用，我們比較結腸癌HCT-8細胞轉染 ZIC1質粒前后的變化，RT-PCR及蛋白質印跡顯示實驗組ZIC1的表達高于空白對照組及陰性對照組，MTT結果顯示在72 h實驗組 HCT-8細胞增殖能力較空白對照組及陰性對照組明顯下降，進而說明 ZIC1抑制結腸癌細胞的增殖，該結果與 Gan等［15］在 HCT116、SW480等結腸癌細胞株中的研究類似。

綜上所述，ZIC1與結直腸癌的發生密切相關，并可抑制結腸癌HCT-8細胞的增殖，提示ZIC1在結直腸癌的發生和發展中起到重要作用，但能否應用于臨床還有待于進一步的研究。

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ZIC1 expression in colorectal cancer tissue and its effect on colon cancer cell proliferation

WANG Jie-feng1，LI Peng-fei1，CAO Fang2，LU Wei-jie2，DING Hou-zhong2
（1.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Department of General Surgery，Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300）

R735.3

A

1671-7783（2015）01-0010-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140307

王杰鋒（1987—），男，碩士研究生；丁厚中（通訊作者），教授，碩士生導師，E-mail:dinghouzhong@163.com

2014-12-05 ［編輯］劉星星