雙酚A通過雌激素受體影響小鼠睪丸和附睪蘭尼堿受體基因的表達

王強，吳沂芮，朱靖剛，金珉，陸榮柱，肖杭（.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 03；.南京醫科大學公共衛生學院，江蘇 南京 009）

基礎醫學

雙酚A通過雌激素受體影響小鼠睪丸和附睪蘭尼堿受體基因的表達

王強1，吳沂芮1，朱靖剛1，金珉1，陸榮柱1，肖杭2
（1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.南京醫科大學公共衛生學院，江蘇 南京 210029）

目的：觀察雙酚A對雄性小鼠睪丸和附睪中蘭尼堿受體（ryanodine receptors，RyRs）基因表達的影響及雌激素受體（estrogen receptor，ERα和 ERβ）在其中的作用。方法：將野生型小鼠、ERα基因敲除小鼠（αERKO）和 ERβ基因敲除小鼠（βERKO）均隨機分為雙酚A組［100 μg/（kg·d）］和對照組，經口灌胃染毒 30 d后（對照組以玉米油灌胃），熒光定量PCR法檢測睪丸和附睪中RyR1，RyR2和RyR3 mRNA表達的變化。結果：雙酚A可使小鼠睪丸中RyR1和RyR3 mRNA表達水平均明顯升高，而RyR2 mRNA表達水平顯著降低，附睪中RyR1、RyR2和RyR3 mRNA表達水平明顯升高（P均＜0.05）。應用 ERKO小鼠實驗結果顯示，雙酚A通過 ERα和 ERβ影響睪丸RyR2以及附睪RyR2和RyR3 mRNA的表達，對附睪RyR1 mRNA的調控則依賴于 ERα。結論:雙酚A可以影響雄性小鼠睪丸和附睪中蘭尼堿受體3種亞型的基因表達，ERα和 ERβ在此過程中發揮了重要作用。

雙酚A；蘭尼堿受體；雌激素受體基因；小鼠

［Abstract］Objective:To explore the possible effects of bisphenol A on ryanodine receptors（RyRs）in mouse testis and epididymis，the role of the two ERs was also investigated.Methods:Adult male wild type （WT），ERs knock out mice（αERKO and βERKO）were randomly divided into control and bisphenol A ［100 μg/（kg·d）for 30 days via intragastric administration］treatment groups.Quantitative real time PCR was used to examine RyR1，RyR2 and RyR3 genes of the testis and epididymis.Results:The mRNA expression of RyR1 and RyR3 were increased in bisphenol A-treated animals，however，RyR2 was evidently decreased.In the epididymis，the mRNA expression of RyR1，RyR2 and RyR3 were significantly increased （P＜0.05）.Bisphenol A up-regulation of RyR1 of the epididymis mRNA expression was dependent on ERα，whereas bisphenol A regulation of RyR2 of the testis and RyR2，RyR3 of the epididymis appeared to be dependent on both ERα and ERβ.Conclusion:The ERs signalling was necessary for the regulation of the RyR channels mRNA expression by bisphenol A，which could affect the male reproductive function.

［Key words］bisphenol A；ryanodine receptors；estrogen receptors；mouse

雙酚A是制造聚碳酸酯塑料、食品罐頭的內襯以及一些紙質收據的原料。材質試驗研究發現，市售的奶瓶、奶杯、瓶子、薄膜等均可檢出雙酚A，而且蔬菜罐頭等食品中也可檢出雙酚A，表明食品包裝材料中的雙酚A會遷移至食品中。流行病學調查發現，不同年齡、不同地區人群尿液和血液中均可檢測到雙酚A。雙酚A屬于環境雌激素，化學結構與雌激素結構類似，能夠與雌激素受體（estrogen receptors，ERs）結合，影響細胞信號傳導途徑或模仿及干擾內源性雌激素的作用。在低濃度長時間暴露的情況下，雙酚A可以對原代和子代生殖系統及其發育、對腦和神經系統、免疫系統等產生不良影響［1］。

國外研究發現，雙酚A能夠透過血睪屏障并直接干擾精子的生長發育及活性，從而對雄性生殖系統產生毒性作用［2］，引起生殖障礙及發育異常。我們前期的實驗結果也顯示，雙酚A可導致雄性小鼠睪丸組織發生病理變化，附睪臟器系數降低，精子畸形率升高；應用雌激素受體基因敲除（αERKO和βERKO）小鼠模型發現 ERα和 ERβ在雙酚A影響雄性生殖系統功能的過程中可能起了重要作用［3］。

胞內 Ca2+濃度的改變是雄性生殖細胞信號通路中重要的轉導因素，參與調節精子和生精細胞不同水平的生理活動［4］。蘭尼堿受體（ryanodine receptors，RyRs）是存在于內質網/肌漿網上的一種內鈣釋放通道，能迅速將 Ca2+從內質網/肌漿網中釋放出來，從而發揮一系列的生理功能。根據分布和生物物理學特征的不同，RyRs可分為 3個亞型: RyR1、RyR2、RyR3。蛋白質印跡和熒光定量PCR檢測發現，在小鼠睪丸發育到成熟過程中均有RyR1的表達，主要表達于精原細胞、粗線期精母細胞和圓形精子細胞［5］。實驗研究發現雙酚A可以引起神經和生殖系統等多種細胞胞內Ca2+濃度的變化。Quesada等［6］發現雙酚A與膜雌激素受體結合后可以促進細胞內 Ca2+的迅速釋放進而導致細胞內游離鈣離子濃度升高。雙酚A通過外鈣內流的途徑升高HT-22海馬神經元細胞胞內 Ca2+濃度［7］；四溴雙酚A能夠升高小鼠睪丸支持細胞株 TM4細胞胞內Ca2+濃度［8］。

本研究采用動物實驗探討環境雌激素雙酚A對雄性小鼠睪丸和附睪中RyRs基因表達的影響，并通過應用ERα基因敲除小鼠（αERKO）和 ERβ基因敲除小鼠（βERKO）觀察 ERα和 ERβ在此過程中的作用，為以雙酚A為代表的環境雌激素生殖毒性機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

野生型小鼠（WT）、αERKO和βERKO小鼠，均為雄性，18～22 g，飼養于南京醫科大學實驗動物中心 SPF級屏障環境中。DMSO、玉米油和雙酚A為Sigma公司產品，總RNA提取試劑盒為Invitrogen公司產品，反轉錄試劑盒和熒光定量 PCR試劑盒為TaKaRa公司產品。梯度基因擴增儀（Biometra公司，德國），ABI7300熒光定量 PCR儀（ABI公司，美國）。

1.2 方法

雙酚A溶于 DMSO中配成母液（10 mg/mL），用玉米油稀釋成10 μg/mL。野生型小鼠隨機分成2組:雙酚A組和對照組，每組10只。雙酚A組小鼠連續30 d經口灌胃雙酚A染毒，劑量為100 μg/ （kg·d）；對照組小鼠給予溶解于 DMSO的玉米油。ERKO小鼠分組和處理方法同野生型小鼠。處死小鼠后，分離睪丸和附睪。利用 Trizol法提取組織中的總 mRNA。按照逆轉錄反應試劑說明書對提取的mRNA進行逆轉錄成 cDNA，然后應用 ABI7300熒光定量PCR儀進行實時定量PCR，引物序列見表1，基因定量采用18s rRNA作為內參，用公式 2-△△CT計算。每個樣品重復4次，用熔解曲線確定 PCR產物是否單一，根據標準曲線得出擴增效率。

表1 引物序列

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析，所有數據均以均數 ±標準差的形式表示，兩組間比較用t檢驗，多組間的比較用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3類小鼠睪丸和附睪組織RyRs mRNA的相對表達量

熒光定量 PCR實驗結果顯示，與野生型小鼠比較，αERKO和βERKO小鼠睪丸中RyR1和RyR2 mRNA的表達水平均明顯降低，RyR3 mRNA表達明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。RyR1和RyR2 mRNA表達水平在αERKO小鼠附睪中明顯升高，而在βERKO小鼠附睪中的表達顯著降低；RyR3 mRNA在αERKO和βERKO小鼠的表達水平均明顯降低（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 3類小鼠睪丸和附睪組織各亞型蘭尼堿 mRNA的表達水平

2.2 雙酚A對各類小鼠睪丸和附睪RyRs mRNA表達的影響

采用熒光定量PCR實驗，觀察雙酚A對雄性野生型小鼠睪丸和附睪RyR1、RyR2和RyR3 mRNA表達的影響。結果顯示，與對照組（玉米油）比較，雙酚A組小鼠睪丸RyR1和RyR3 mRNA表達明顯升高，但RyR2 mRNA表達水平明顯降低（P均＜0.05）。附睪中RyR 3種亞型的表達水平均明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

與雙酚A影響野生型小鼠RyRs結果（升高）類似，雙酚A能明顯升高αERKO和βERKO小鼠睪丸組織中RyR1和RyR3 mRNA的表達（P＜0.05）。但睪丸中RyR2 mRNA表達水平亦明顯升高（P＜0.05），這個結果與野生型組的結果（降低）相反。雙酚A能夠使αERKO小鼠附睪中RyR1 mRNA表達明顯降低（P＜0.05），但βERKO小鼠附睪RyR1 mRNA表達明顯升高。與野生型小鼠結果（升高）不同，雙酚A明顯降低了αERKO和βERKO小鼠附睪RyR2和RyR3 mRNA的表達水平（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 雙酚A對野生型和 ERKO小鼠睪丸和附睪蘭尼堿受體 mRNA表達的影響

3 討論

大量動物實驗證明雙酚A可以影響雄性生殖系統［9］。細胞內鈣穩態及 Ca2+濃度在生精細胞分化成熟、精子頂體反應和獲能過程中均發揮著重要作用。許多實驗研究結果顯示，雙酚A可以引起細胞內Ca2+濃度的變化并影響調控鈣穩態相關的離子通道或受體的表達。雙酚A可以影響小鼠腎臟和十二指腸中兩種參與鈣轉運的基因TRPV5和CaBP-9k表達，提示雙酚A可以通過改變調控鈣穩態相關的離子通道或受體表達來影響胞內 Ca2+濃度［10］。研究還發現雙酚A可以升高 HT-22細胞、大鼠海馬神經元等多種細胞胞內Ca2+濃度，并提示雙酚A引起胞內 Ca2+濃度升高可能是通過外鈣內流和內鈣釋放兩類途徑。我們以前的實驗也發現雙酚A能夠呈濃度依賴性增加精母細胞系 GC-2細胞胞內Ca2+濃度，并影響鈣調蛋白、鈣調蛋白激酶2及其磷酸化的表達［11］。本研究觀察了雙酚A對雄性小鼠睪丸和附睪中位于內質網/肌漿網上的內鈣釋放通道RyRs表達的影響，探討雙酚A影響胞內鈣穩態的可能作用途徑。

我們的前期研究發現雙酚A能夠模擬雌激素的作用，通過雌激素受體介導機制對雄性生殖系統產生毒性作用［3］。為了觀察雙酚A通過雌激素受體對雄性小鼠生殖系統中調控胞內鈣穩態具有重要作用的RyRs的影響，本研究采用動物體內試驗和熒光定量 PCR檢測基因的表達。結果提示雙酚A通過 ERα和 ERβ影響睪丸RyR2和附睪RyR2、RyR3 mRNA表達，對附睪RyR1 mRNA的調控則依賴于 ERα。

蘭尼堿受體對保持胞內鈣的平衡起著重要作用。我們的實驗結果發現雙酚A可以影響蘭尼堿受體3種亞型的基因表達，ERα和 ERβ在此過程中發揮了重要作用，提示雙酚A可能會以蘭尼堿受體為作用靶點影響胞內鈣離子濃度以及生殖細胞的功能。但雙酚A可能還通過其他途徑影響雄性生殖系統，這尚需進一步的研究來證實。

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Effects of bisphenol A on ryanodine receptors in mouse testis and epididymis:role of estrogen receptors

WANG Qiang1，WU Yi-rui1，ZHU Jing-gang1，JIN Min1，LU Rong-zhu1，XIAO Hang2
（1.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.School of Public Health，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

R992

A

1671-7783（2015）01-0001-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140276

國家自然科學基金資助項目（81400911）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK20140573）；中國博士后科學基金資助項目（2014M560407）；江蘇大學高級人才基金資助項目（12JDG083）；江蘇省博士后科研基金資助項目（1301045B）；現代毒理學教育部重點實驗室（南京醫科大學）開放基金資助項目（NMUMT201402）

王強（1983—），男，山東壽光人，講師，博士，主要從事毒理學研究。

2014-10-22 ［編輯］陳海林