半纖維素熒光探針的構建與應用

裴海生，鄭宏臣，王民敬，陳　洲，孫君社*（.農業部規劃設計研究院，北京 005；.中國科學院 天津工業生物技術研究所，天津 300308）

半纖維素熒光探針的構建與應用

裴海生1，鄭宏臣2，王民敬1，陳洲1，孫君社1*
（1.農業部規劃設計研究院，北京 100125；2.中國科學院 天津工業生物技術研究所，天津 300308）

該研究將綠色熒光蛋白（GFP）同木聚糖酶底物結合域（XBD）結合，構建了能夠特異性結合半纖維素的熒光探針，經激光掃描共聚焦顯微鏡比較分析GFP和GFP-XBD熒光融合蛋白對玉米秸稈的結合差異，發現GFP-XBD熒光融合蛋白溶液處理玉米秸稈半纖維素所在區域熒光信號強度明顯高于其他樣品，表明所構建的半纖維素熒光探針可以與細胞壁中半纖維素特異性結合。熒光測定結果顯示，GFP和GFP-XBD的蛋白含量與熒光強度之間有著良好的線性關系（R12=0.994 4，R22=0.995 1），成功地表征了玉米秸稈預處理過程中半纖維素的變化規律，最終確定最佳的預處理溫度為130℃。

半纖維素；綠色熒光蛋白；木聚糖酶底物結構域；熒光探針

木質纖維素主要是由纖維素、半纖維素和木質素等組分所構成的超分子功能結構的聚集體［1］。在長期的自然演變過程中，木質纖維素進化出復雜的化學組分及超微分子結構，形成了應對微生物和酶攻擊降解的天然屏障［2］，使得目前單獨利用生物法轉化的效率遠遠不能適應大規模工業化需求［3］。木質纖維素的這種抗降解屏障特性［4-5］要求必須對原料進行預處理，才能夠實現生物煉制的第一步——組分分離。半纖維素是木質纖維素中的第二大組分，約占20%～35%，是預處理的主要研究對象之一，其轉化利用主要發生在預處理階段。半纖維素本身可作為膽固醇抑制劑和藥片分解劑，其水解可制備功能性低聚糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等，得到的糖可進一步生產木糖醇、乙醇、丁醇、有機酸、糠醛等液體生物燃料或大宗化工產品［6］。半纖維素用來生產高附加值的工業產品更有前景，充分利用纖維素和半纖維素組分并使其產品價值最大化，可以降低醇類液體燃料的生產成本，提高木質纖維素綜合生物煉制的經濟效益［7］。考慮到半纖維素固有的復雜性、類型的多樣性以及各種化學預處理所產生的降解產物的多樣性，利用木聚糖酶將半纖維素定向降解為木糖或低聚木糖產物成為近年來研究的熱點［8-12］。木聚糖酶具有一個普遍的特征：酶分子是由一個或多個蛋白結構域構成的，每個酶分子常常包含催化模塊和碳水化合物結合模塊（carbohydrate binding modu1e，CBM）。CBM在纖維素類降解酶系中普遍存在，其作用是與纖維素或半纖維素表面結合，將催化結構域拉近到不溶性的纖維素或半纖維素表面，使這些結合結構域能特異的結合相應的不溶性底物并對酶的穩定性有所影響，使水解過程易于進行［13］。

為了考察預處理過程生物質原料微觀結構的變化情況及半纖維素在預處理過程中的溶出規律，本研究應用分子生物學技術構建了能夠特異性結合半纖維素的探針，該探針是由綠色熒光蛋白（green f1uorescent protein，GFP）和木聚糖底物結合域CBM6_36_xy1anase-1ike（xy1ansubstrate domain，XBD）構成的融合蛋白，并進一步驗證了探針同玉米秸稈原料中半纖維素結合的特異性。確立了一種表征木質纖維素中半纖維素降解機制的物理檢測方法，并應用該方法初步探索了不同溫度稀酸預處理對玉米秸稈中半纖維素降解的規律。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料

玉米秸稈（紀元一號）：采收于河北省衡水市，采收后的秸稈原料進行干燥、粉碎，過40目篩后，貯存在塑料袋中，-20℃保藏。經成分分析，其組成為：纖維素35.23%，木聚糖17.33%，阿拉伯聚糖4.16%，半乳聚糖3.26%，木質素18.90%，灰分6.90%，蛋白質5.44%，其他8.78%。

1.1.2菌株及質粒

本研究所用菌株及質粒如表1所示。

表1　試驗所用菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in the experiments

1.1.3主要試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonuc1eic acid，DNA）聚合酶（2.5 U/μL）、限制性內切酶（10 U/μL）：美國NEB公司；質粒提取試劑盒、普通聚合酶鏈反應（po1ymerase chain reaction，PCR）產物回收試劑盒、膠回收試劑盒：美國Omega生物技術公司；其他試劑為國產分析純。

1.2儀器與設備

DYY-III電泳槽：北京六一儀器廠；GeneGenius全自動凝膠成像儀：美國SYNGENE公司；PTC-200型PCR基因擴增儀：美國伯樂BIO-RAD公司；LEXT OLS4100激光掃描共聚焦顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司；Infinite F50多功能酶標儀：瑞士帝肯（Tecan）貿易有限公司。

1.3方法

1.3.1熒光融合蛋白編碼基因的構建

以木聚糖酶XynG1-1的編碼基因為模板，設計引物XBD P1和XBD P2（見表2）擴增該基因中編碼木聚糖底物結合域CBM6_36_xy1anase-1ike（XBD）的編碼基因。

重疊PCR需要設計4條引物（見表2），其中P1和P4分別為GFP編碼基因的N端上游引物和XBD的C段下游引物，用于擴增重組基因全長的上下游引物，引物兩端要添加與載體連接所用的酶切位點及保護堿基，P2和P3是兩條同時含有兩個基因相連接的部分基因片段的反向互補引物；PCR擴增分兩輪進行，第一輪以攜帶目的基因的質粒為模板（適當稀釋），并分別以P1、P2和P3、P4為引物，應用Pyrobest高保真DNA聚合酶分別進行PCR擴增反應，最終得到重組的熒光融合蛋白編碼基因，進行下一步操作。

表2　分子克隆所用模板、引物及擴增方法Table 2 Template，primers and PCR method for molecular cloning

1.3.2重組熒光融合蛋白表達載體的構建及表達

應用EcoRI和HindIII同步雙酶切PCR產物及載體DNA（pET22b）。酶切后的DNA產物及載體DNA使用膠回收試劑盒回收。載體DNA與PCR產物按物質的量比1∶1～1∶10混合，再加入等體積的DNA連接試劑盒中的So1ution I，在16℃恒溫連接2～4 h。隨后通過電轉化將構建載體轉入E.co1iDH5α感受態細胞，取100μL培養液涂布到氨芐青霉素（Ampici11in，Amp）抗性平板上，37℃倒置培養16～20 h；在平板上挑取陽性轉化子，進行菌體PCR驗證。驗證正確的陽性重組子活化后，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy1-β-D-thioga1actoside，IPTG）（終濃度為1mmo1/L）誘導表達發酵，20℃、100 r/min誘導16 h。發酵液經4 000 r/min離心10 min，所得細胞進行超聲破碎后，4℃、12 000 r/min離心10min取上清液，得到重組熒光融合蛋白粗溶液，再對該粗溶液應用鎳離子親和層析進行一步純化［14］。

1.3.3GFP-XBD探針對半纖維素特異性吸附試驗

選擇自然風干的玉米秸稈，制成約為25 μm厚的切片。將切片浸泡在含有100 μg/mL GFP或GFP-XBD蛋白的溶液中約10 min。然后取出切片，置于盛有去離子水的容器中，反復洗滌3次，洗去沒有結合在半纖維素上的GFP或GFP-XBD蛋白。最后將洗滌過的切片做成玻片標本，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

激光掃描共聚焦顯微鏡設置為：Ar/ArKr激光器激發波長488nm，檢測發射光波長為492～632 nm，激發值80%，偽彩色使用綠色，通過單次掃描方式進行圖像采集，圖像使用EZ-C1 3.0 FreeViewer分析處理。

1.3.4預處理溫度的選擇

在預處理溫度分別為100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃和160℃條件下對玉米秸稈進行預處理，用硫酸調節pH值為2.0，預處理時間為20 min，料液比為1∶35 （g∶mL），獲得預處理液。

將玉米秸稈預處理液進行抽濾，用去離子水將殘渣洗凈，然后將剩余的玉米秸稈爆破渣進行烘干，粉碎過40目，備用。分別制備純化后的GFP、GFP-XBD熒光蛋白溶液，并稀釋到一定的質量濃度。應用多功能酶標儀分別測定GFP、GFP-XBD熒光蛋白的最佳激發波長和發射波長［15］。在對應的激發波長（490 nm）和發射波長（525 nm）條件下測定2種稀釋后的熒光蛋白溶液的熒光強度，即為初始熒光強度，將待測玉米秸稈樣品與GFP及GFP-XBD溶液以1∶50（g∶mL）的比例在室溫下作用2 h，離心后測上清液的剩余熒光強度。

吸附率是指熒光蛋白非特異性吸附到細胞壁上的部分，其計算公式如下：

吸附結合率是指熒光蛋白特意性吸附以及非特異性吸附到細胞壁上的總比率，其計算公式如下：

結合率是吸附結合率與吸附率之差，反映了熒光探針對秸稈半纖維素特異性結合的強度，其計算公式如下：

結合率=吸附結合率-吸附率

1.3.5玉米秸稈預處理過程中纖維素、半纖維素含量測定

準確稱取干燥后的玉米秸稈殘渣0.3 g放入15 mL試管中，加入3.0 mL 72%的硫酸溶液，漩渦混合，將試管放入30℃水浴鍋中保持60 min，期間每隔5～10 min漩渦混合一次，反應結束后，準確加入去離子水84 mL，放入高壓滅菌鍋中121℃保持1 h，高效液相色譜（high performance 1iquid chromatography，HPLC）法測定水解液的葡萄糖和木糖含量，用于計算樣品中纖維素和半纖維素的含量。樣品中纖維素和半纖維素含量的計算公式如下：

式中：C1為反應液中葡萄糖質量濃度，mg/mL；C2為反應液中木糖質量濃度，mg/mL；V是反應體系總體積，即87 mL；0.9是葡萄糖轉化為纖維素的系數；0.88是木糖轉化為半纖維素的系數；m是待測樣品干物質質量，mg。

纖維素和半纖維素去除率計算公式如下：

纖維素去除率=

2　結果與分析

2.1GFP-XBD探針的構建

通過重疊PCR獲得重組的熒光融合蛋白編碼基因GFP-XBD、GFP和XBD3個基因片段的PCR產物的凝膠電泳圖如圖1所示。由圖1可知，GFP基因全長717 bp，XBD基因全長357 bp，構建的GFP-XBD基因全長為1 074 bp，共編碼358個氨基酸，說明重疊PCR最終得到了重組基因GFP-XBD。隨后構建分別含有GFP-XBD和GFP基因的表達質粒并將其轉入E.co1iBL21進行表達。圖2為GFP-XBD蛋白、GFP蛋白及空白對照在激發光（488 nm）照射下熒光表達情況，由圖2可知，GFP-XBD蛋白、GFP蛋白均能發出明顯的綠色熒光，表明經誘導表達的蛋白具有較高的熒光活性。

圖1　PCR產物分析Fig.1 PCR products analysis

圖2　熒光融合蛋白誘導表達產物的熒光效果Fig.2 Fluorescent effect of expression product by fluorescent fusion protein inducing

2.2GFP-XBD探針對生物質中半纖維素標定的特異性

對未經任何處理的玉米秸稈自發熒光、使用含GFP熒光蛋白溶液處理后玉米秸稈的熒光分布、使用含GFP-XBD熒光融合蛋白溶液處理后玉米秸稈的熒光分布進行研究。為了后續比較，這三組采用的激發值均為80%。結果如圖3所示。

圖3　不同玉米秸稈樣品細胞壁的熒光分布及熒光強度Fig.3 The distribution and intensity of fluorescence of cell wall in different corn stover samples

圖3A為玉米秸稈在激發光波長為488 nm時的自發熒光分布結果，圖3B是圖3A中橫線部分所對應的熒光強度。已有研究表明［14］，在該激發波長下的自發熒光主要來自于植物細胞壁中的木質素。明亮區域代表高熒光強度，表示木質素含量高，由圖3A可知，維管束鞘、后生木質部這些部位的厚壁細胞壁中木質素含量要高于維管束鞘之間的薄壁細胞壁中的木質素含量。由圖3B可知，在該激發值下，細胞壁的自發熒光強度大都在1 000 AU左右。

圖3C為含有GFP蛋白探針溶液處理后細胞壁的熒光分布，圖3D為圖3C中橫線部分所對應的熒光強度。由3C與圖3A相比較可知，熒光分布十分相似，差別在于圖3C的亮度整體比圖3A高一些，圖3D中細胞壁熒光強度在1 500 AU左右。因此，圖3C中細胞壁的熒光一部分來自于細胞壁中木質素的自發熒光，另一部分是來自于細胞壁對GFP熒光蛋白的非特異性吸附。

圖3E是含有GFP-XBD熒光融合蛋白探針溶液處理后細胞壁的熒光分布，圖3F為圖3E中橫線部分所對應的熒光強度。該圖中細胞壁的熒光強度明顯高于圖3B和圖3C的熒光強度，由此可知其熒光強度主要來自于3部分：最主要的部分來自于細胞壁中半纖維素對GFP-XBD熒光蛋白的特異性結合，另一小部分來自于細胞壁中木質素的自發熒光（圖3B），最后一部分是來自于細胞壁對GFP-XBD熒光蛋白的非特異性吸附（圖3D）。由圖3E可知，細胞壁對熒光蛋白的吸附是均勻的，而植物細胞壁自發熒光較弱，因此，暫且使用圖3E熒光分布情況來估測植物細胞壁中的半纖維素分布情況。由圖3F可知，細胞壁熒光強度分布十分不均，從2 000～4 000 AU均有分布。維管束之間的薄壁細胞、維管束中原生木質部區域細胞壁的熒光強度很高，在4 000 AU左右；而位于維管束鞘中的厚壁細胞壁的熒光強度很弱，僅在1 500 AU左右。亮度高代表高熒光強度，表示可以與探針結合的半纖維素含量高。由此推測：維管束之間的薄壁細胞的細胞壁及原生木質部中可以與探針結合的半纖維素含量高。但維管束鞘中可以與探針結合的半纖維素很少，可能是因為該部分細胞壁中木質素含量較高，不利于半纖維素探針的結合，即木質素的存在會影響半纖維素與熒光探針的結合。由以上分析可知，構建的半纖維素探針是可以與細胞壁中半纖維素特異性結合的。

2.3GFP和GFP-XBD蛋白含量與熒光強度的關系

以GFP和GFP-XBD蛋白濃度（x）為橫坐標，以熒光強度（y）為縱坐標，繪制GFP和GFP-XBD蛋白含量與熒光強度之間關系曲線，結果見圖4。

圖4　GFP（A）和GFP-XBD（B）標準曲線Fig.4 Standard curve of GFP（A）and GFP-XBD（B）

由圖4可知，GFP和GFP-XBD的蛋白標準曲線線性回歸方程分別為：y=34920x+1681.5，R12=0.9944、y=23 783x+ 1 021.1，R22=0.995 1；結果表明，GFP和GFP-XBD的蛋白含量與熒光強度之間有著良好的線性關系，這樣可以通過測定樣品的熒光強度來反映樣品蛋白含量，避免了蛋白分離提取環節，應用起來會更加方便可行。

2.4不同預處理溫度對熒光融合蛋白結合底物的影響

稀酸高溫預處理能夠破壞玉米秸稈固有結構，提高后期酶解效率，但是溫度過高會造成單糖損失，過低則無法破壞初始結構，因此選擇在100～160℃下稀酸處理玉米秸稈，隨后考察了GFP-XBD結合纖維素及半纖維素的去除率變化情況，結果分別見圖5、圖6。

圖5　不同預處理溫度對GFP-XBD結合半纖維素的影響Fig.5 Effect of different pretreatment temperature on GFP-XBD combining with hemicellulose

圖6　不同預處理溫度對半纖維素、纖維素去除率的影響Fig.6 Effect of different pretreatment temperature on removal rate of hemicellulose and cellulose

由圖5可知，隨著預處理溫度的提高，玉米秸稈底物對熒光蛋白的吸附率逐漸升高，這是由于預處理溫度越高，玉米秸稈的結構越松散，半纖維素溶出增加，增大了玉米秸稈的表面積；而在100～130℃，玉米秸稈結合木聚糖酶底物結合結構域（GFP-XBD）的能力隨溫度升高而升高，在130℃達到最大值，為90%。當預處理溫度＞130℃時，玉米秸稈結合木聚糖酶底物結合結構域的結合率逐漸下降，由圖6可知，這是由于預處理溫度＞130℃后，半纖維素去除率開始迅速增加，玉米秸稈半纖維素大部分溶出，固體半纖維素減少，從而導致GFP-XBD結合率降低。綜合分析，預處理溫度為130℃時，玉米秸稈半纖維素和纖維素溶出較少，但結構已經松散，半纖維素結合GFP-XBD的結合率可達80%，說明此時應用木聚糖酶酶解半纖維素將會達到較高降解率，并且預處理溫度不高，可節約能耗，因此，選擇預處理溫度為130℃。

3　結論

本研究成功構建了融合熒光蛋白GFP-XBD的大腸桿菌表達體系，經激光掃描共聚焦顯微鏡比較分析GFP熒光蛋白和GFP-XBD熒光融合蛋白對玉米秸稈的結合差異，發現GFP-XBD熒光融合蛋白溶液處理秸稈半纖維素所在區域熒光信號強度明顯高于其他樣品，表明所構建的半纖維素探針可以與細胞壁中半纖維素特異性結合。熒光測定結果顯示，GFP和GFP-XBD的蛋白含量與熒光強度之間有著良好的線性關系，成功地表征了玉米秸稈預處理過程中半纖維素的變化規律，最終確定最佳的預處理溫度為130℃。由此可見，利用熒光探針方法可以表征木質纖維素預處理過程中半纖維素降解規律，進而選擇最佳的預處理工藝及條件，可為生物質資源的高效利用開辟一條新的途徑。

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Construction and app1ication of hemice11u1ose f1uorescent probe

PEI Haisheng1，ZHENG Hongchen2，WANG Minjing1，CHEN Zhou1，SUN Junshe1*
（1.Chinese Academy of Agricu1tura1 Engineering，Beijing 100125，China；2.Tianjin Institute of Industria1 Biotechno1ogy，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

The f1uorescence probe which cou1d specifica11y bind to hemice11u1ose was constructed with combination of green f1uorescent protein（GFP）and xy1anase substrate domain（XBD）.The differences of GFP and GFP-XBD on combining corn stover were compared and ana1yzed by confoca1 1aser scanning microscope.The f1uorescence signa1 intensity of corn stover hemice11u1ose by GFP-XBD so1ution was significant1y higher than other samp1es.The resu1ts indicated that the hemice11u1ose f1uorescent probe cou1d specifica11y bind to hemice11u1ose of ce11 wa11.The resu1ts of f1uorometric ana1ysis showed that protein content of GFP and GFP-XBD had a good 1inear re1ationship with f1uorescence intensity（R12=0.994 4，R22=0.995 1）. The change pattern hemice11u1ose was described successfu11y during corn stover pretreatment process.At 1ast，the optimum pretreatment temperature was determined as 130℃.

hemice11u1ose；green f1uorescent protein；xy1anase substrate domain；f1uorescent probe

Q939.97

A

0254-5071（2015）12-0132-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.029

2015-09-17

國家自然科學基金（21176247）

裴海生（1981-），男，工程師，博士，研究方向為生物質資源綜合利用。

孫君社（1961-），男，教授，博士，研究方向為生物技術與酶工程。