響應面法優化酸馬乳發酵工藝的研究

張亞南，王小標，張志臻，王　威，王　沛，武　運*（.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 83005；.新疆農業大學 科學技術學院，新疆 烏魯木齊 83005）

響應面法優化酸馬乳發酵工藝的研究

張亞南1，王小標1，張志臻2，王威1，王沛1，武運1*
（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學 科學技術學院，新疆 烏魯木齊 830052）

以酸馬乳中乳酸菌活菌數為評價指標，研究了不同發酵條件對酸馬乳中乳酸菌活菌數的影響，在單因素的基礎上采用響應面試驗優化酸馬乳的發酵工藝條件。結果表明，酸馬乳最佳發酵條件為：干酪乳桿菌∶乳酸乳球菌∶酵母菌=1∶1∶2，接種量6%，發酵時間48 h，發酵溫度32℃，不添加蔗糖。在此最佳條件下，酸馬乳中乳酸菌活菌數對數值可達8.673 9，酵母菌活菌數對數值為7.628 4，酸度6.34 g/L，酒精度1.2%vo1。

酸馬乳；乳酸菌；酵母菌；發酵工藝優化

酸馬乳又稱馬奶酒、策格、艾日格，是以新鮮馬乳為原料，經過乳酸菌和酵母菌混合發酵而成的一種酸性、低醇馬乳飲料，深受內蒙古、新疆等地游牧民族的青睞。馬乳中各種營養成分組成與母乳較為接近，尤其是乳清蛋白與酪蛋白的比例［1-2］。乳清蛋白比酪蛋白更易被人體消化吸收，馬乳中乳清蛋白在馬乳總蛋白中所占比例較高，營養價值較高［3］。馬乳富含氨基酸、維生素C、乳糖和較少的脂肪，其中人體必需氨基酸占馬乳中總氨基酸的43%；少量的脂肪中，尤其是亞麻酸和亞油酸含量較高［4-8］。經臨床研究發現，發酵酸馬乳具有降血壓、降血脂、調節胃腸系統和神經系統、增強機體免疫力等作用，對高血壓、冠心病、糖尿病、肺結核、肺氣腫等疾病有一定療效［9-11］。酸馬乳的醫療保健作用除了與酸馬乳中的營養成分有關外，還與酸馬乳中乳酸菌的活菌數及其發酵過程中代謝產物密切相關。國標GB 19302—2010《發酵乳》中規定發酵乳中乳酸菌數≥1×106CFU/g（mL）。有研究表明，每日攝入1×108～1×109CFU/mL的活性乳酸菌菌體，才能發揮良好的保健功能［12］。

本研究以新鮮馬乳為原料，從新疆傳統酸馬乳中分離得到的干酪乳桿菌（Lactobaci11us casei）MLS5、乳酸乳球菌（Lactococus 1actis）WLB5和馬克思克魯維酵母菌（K1uyveromyces marxianus）WMMJ1為發酵菌株，以酸馬乳中乳酸菌活菌數為考察指標，通過單因素試驗和響應面試驗優化酸馬乳發酵工藝參數，為新疆地區酸馬乳的產業化生產提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮馬乳：購于新疆烏魯木齊南山地區。

干酪乳桿菌（Lactobaci11us casei）MLS5、乳酸乳球菌（Lactococus 1actis）WLB5和馬克思克魯維酵母菌（K1uyveromyces marxianus）WWMJ1：新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室。MRS肉湯培養基、改良MC瓊脂培養基、酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YEPD）培養基、孟加拉紅培養基：青島日水生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

FA2014N分析天平：北京東南儀誠實驗室設備有限公司；HR40-IIA2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DHP-9052電熱恒溫培養箱、HWS-26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；FE20K pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1單因素試驗設計

通過單因素試驗分別考察總接種量（2%、4%、6%、8%、10%，V/V）、干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和酵母菌接種比例（1∶1∶2、1∶1∶4、1∶1∶1、1∶1∶6、3∶3∶2）、發酵溫度（24℃、27℃、30℃、33℃、36℃）、發酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、蔗糖添加量（0、2%、4%、6%、8%）對發酵酸馬乳中乳酸菌、酵母菌生長的影響，試驗平行進行2次。

1.3.2響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以接種量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）為考察因子，以酸馬乳中乳酸菌活菌數（Y）為響應值，利用Design-Expert 8.05中的Box-Behnken Design進行響應面試驗設計，因素與水平編碼值表見表1。

表1　Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3檢測指標

（1）活菌計數

酸馬乳中乳酸菌活菌計數采用改良MC瓊脂培養基傾注培養，放置于37℃恒溫培養箱中培養2 d后計數；酸馬乳中酵母菌活菌計數采用孟加拉紅瓊脂培養基涂布培養，放置于28℃恒溫培養箱中培養2 d后計數［13］。

（2）總酸的測定

按照國標GB/T 23546—2009《奶酒》中總酸測定方法測定酸馬乳的總酸。

（3）酒精度的測定

采用酒精計法測定酸馬乳的酒精含量［14］。

（4）還原糖的測定

還原糖的測定采用國標GB/T 23546—2009《奶酒》中總糖測定方法中的廉愛農法，其中用酸馬乳樣品代替試樣水解液。

（5）衛生指標

酸馬乳中大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的測定按照國標GB 19302—2010《發酵乳》中的方法進行。

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1蔗糖添加量對酸馬乳發酵特性的影響

不同蔗糖添加量對酸馬乳發酵特性的影響如圖1所示。

圖1　蔗糖添加量對酸馬乳中乳酸菌活菌數及酵母菌活菌數的影響Fig.1 Effect of sucrose addition on the viable counts of lactic acid bacteria and yeast in koumiss

由圖1可知，在酸馬乳發酵過程中不添加蔗糖，發酵結束后，酸馬乳中乳酸菌活菌數最高，達到8.64841gCFU/mL。原因可能是生鮮馬乳中乳糖含量較高，可為乳酸菌的生長提供豐富的碳源和其他營養物質。蔗糖添加量在2%～6%時，酸馬乳中乳酸菌活菌數先升后降，酵母菌活菌數有所升高。當蔗糖添加量為6%時，酵母菌活菌數最高，達到7.82281gCFU/mL。原因可能是添加蔗糖為酵母菌提供了適宜的碳源，酵母菌利用蔗糖快速生長，并代謝生成大量的乙醇等代謝產物，對乳酸菌的生長有一定的抑制作用。當蔗糖添加量為8%時，酸馬乳中乳酸菌活菌數有所增加，酵母菌活菌數有所下降，可能是由于蔗糖濃度較高，抑制了酵母菌的生長。綜合考慮，在酸馬乳發酵過程中，選擇不添加蔗糖較為適合。

2.1.2接種比例對酸馬乳發酵特性的影響

干酪乳桿菌∶乳酸乳球菌∶酵母菌接種比例對酸馬乳發酵特性的影響如圖2所示。

圖2　接種比例對酸馬乳中乳酸菌活菌數及酵母菌活菌數的影響Fig.2 Effect of inoculation ratio on the viable counts of lactic acid bacteria and yeast in koumiss

由圖2可知，當干酪乳桿菌∶乳酸乳球菌∶酵母菌比例為1∶1∶2時，發酵結束后酸馬乳中乳酸菌活菌數最高，達到8.63851gCFU/mL。原因可能是酸馬乳發酵過程中，酵母菌代謝生成氨基酸、維生素等生長因子，促進了乳酸菌的生長。然而，當乳酸菌接種比例增加時，乳酸菌活菌數反而有所下降。原因可能是當乳酸菌接種比例較高時，由于乳酸菌的蛋白水解能力較弱，不能合成維生素、氨基酸等生長所需物質，或者合成量不足以滿足乳酸菌的生長［15］，導致乳酸菌活菌數降低。當酵母菌接種比例增加時，尤其是干酪乳桿菌∶乳酸乳球菌∶酵母菌接種比例為1∶1∶4時，發酵結束后酸馬乳中酵母菌活菌數最高，達到7.71181gCFU/mL，而乳酸菌活菌數僅有8.46981gCFU/mL。原因可能是當酵母菌接種比例較高時，發酵過程中酵母菌生長占優勢，與乳酸菌生長形成營養競爭，或產生乙醇等物質抑制乳酸菌生長。綜合考慮，選擇干酪乳桿菌∶乳酸乳球菌∶酵母菌接種比例為1∶1∶2較為合適。

2.1.3接種量對酸馬乳發酵特性的影響

接種量對酸馬乳發酵特性的影響如圖3所示。

圖3　接種量對酸馬乳中乳酸菌活菌數及酵母菌活菌數的影響Fig.3 Effect of inoculum on the viable counts of lactic acid bacteria and yeast in koumiss

由圖3所示，當接種量為2%～4%時，由于接種量較小，酸馬乳中發酵菌株的適應期較長，造成菌體細胞生長量?。?7］，乳酸菌和酵母菌的活菌數均較低。當乳酸菌和酵母菌總接種量為6%時，酸馬乳中乳酸菌活菌數最高，達到8.64351gCFU/mL。當接種量6%～8%時，乳酸活菌數下降，而酵母菌活菌數增加。當乳酸菌和酵母菌總接種量為10%時，酸馬乳中酵母菌活菌數最高，達到7.826 1 1gCFU/mL?？赡苁且驗樗狁R乳發酵過程中攪拌或振蕩操作會提高馬乳中的溶解氧量，有利于酵母菌的生長，而且酵母菌接種量越大，酵母菌的生長優勢較為明顯。研究表明，在有氧發酵時，無論是單菌發酵還是與乳酸菌混合發酵，酵母菌生長占優勢，尤其是酵母菌接種量最大時，酵母菌代謝生成乙醇，抑制乳酸菌生長［16］。綜合考慮，接種量為6%時較為適宜。

2.1.4發酵溫度對酸馬乳發酵特性的影響

發酵溫度對酸馬乳發酵特性的影響如圖4所示。

圖4　發酵溫度對酸馬乳中乳酸菌活菌數及酵母菌活菌數的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the viable counts of lactic acid bacteria and yeast in koumiss

由圖4可知，不同發酵溫度對酸馬乳發酵過程乳酸菌、酵母菌活菌數影響很大。發酵溫度過高或過低均不利于酵母菌生長代謝，乙醇等風味化合物生成量較少，發酵乳風味不佳［18］。當發酵溫度為24℃時，酸馬乳中乳酸菌生長緩慢，活菌數較低；酵母菌活菌數最高，為7.770 9 1gCFU/mL。原因可能是乳酸菌和酵母菌的最適生長溫度不同，發酵溫度較低時，乳酸菌的生長受到抑制，而酵母菌可以利用馬乳中的營養物質快速生長。當發酵溫度為27～33℃時，酸馬乳中乳酸菌和酵母菌快速生長，酸馬乳中乳酸菌、酵母菌活菌數較高，分別為8.596 6 1g CFU/mL和7.740 4 1g CFU/mL。原因可能是隨著發酵溫度的升高，乳酸菌的生長速度加快，活菌數升高；而酵母菌可能與乳酸菌之間的產生營養競爭，活菌數有所下降。當發酵溫度為36℃時，酸馬乳中乳酸菌生長旺盛，活菌數達到最大值為8.63851gCFU/mL；但是酵母菌活菌數較低。可能是由于發酵溫度較高，抑制了酵母菌的生長，同時加速了酵母菌的衰亡。綜合考慮，選擇發酵溫度33℃為宜。

2.1.5發酵時間對酸馬乳發酵特性的影響

發酵時間對酸馬乳發酵特性的影響如圖5所示。

圖5　發酵時間對酸馬乳中乳酸菌活菌數及酵母菌活菌數的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the viable counts of lactic acid bacteria and yeast in koumiss

由圖5可知，不同發酵時間對酸馬乳發酵過程乳酸菌、酵母菌活菌數影響很大。當發酵時間24～48 h時，酸馬乳中乳酸菌活菌數最高，并且酸馬乳中乳酸菌、酵母菌活菌數分別在36 h、48 h達到最大值，分別為8.65801gCFU/mL、7.73241gCFU/mL。當發酵時間48～72 h時，酸馬乳中乳酸菌、酵母菌活菌數均呈下降趨勢。原因可能是發酵24 h后，乳酸菌和酵母菌生長進入穩定期，活菌數變化不大，但當發酵時間＞60 h后，乳酸菌和酵母菌生長進入衰亡期，活菌數有所下降。綜合考慮發酵時間過短，酸馬乳中的風味物質生成量較少，風味不佳，因此選擇發酵時間48 h為宜。

2.2酸馬乳發酵條件的優化

2.2.1響應面試驗設計與結果

根據Box-Behnken試驗設計原理，以接種量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）為自變量，以酸馬乳中乳酸菌活菌數（Y）為響應值，進行3因素3水平試驗，響應面試驗設計及結果見表2，回歸模型方差分析結果見表3。

表2響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

對表2響應面優化試驗結果進行多元非線性回歸分析，得到接種量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）對酸馬乳中乳酸菌活菌數的擬合方程為：Y=8.62-0.066A+ 0.18B-0.0013C+0.072AB+0.027BC-0.053A2-0.11B2-0.069C2。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，本試驗建立的多元回歸模型F=29.54，P＜0.0001，表明回歸模型極顯著；而模型失擬項P=0.062 6＞0.05，說明回歸模型失擬項不顯著，由此說明所建立的多元回歸模型具有良好的顯著性。模型決定系數R2=0.974 3，校正決定系數R2Adj=0.941 4，表明該多元回歸模型能較好擬合實際試驗中響應值的變化，利用此多元回歸模型可以對酸馬乳中乳酸菌活菌數進行分析和預測。在α=0.05的顯著水平上，一次項A和B、交互項AB和二次項B2、C2對酸馬乳中乳酸菌活菌數（Y）的影響均為極顯著（P＜0.01），二次項A2對酸馬乳中乳酸菌活菌數（Y）存在顯著的影響（P＜0.05）。

2.2.2響應面分析與優化

利用Design-Expert 8.05軟件對回歸模型進行響應面優化，運用Sigmap1ot 12.5繪制交互項三維響應面圖和等高線如圖6所示。

圖6　接種量、發酵溫度與發酵時間交互作用對乳酸菌活菌數影響的響應面Fig.6 Response surface plots of effects of interaction between inoculum，fermentation temperature and fermentation time on viable counts of lactic acid bacteria

由圖6可知，可以比較直觀看出接種量、發酵溫度和發酵時間兩兩之間交互作用對酸馬乳中乳酸菌活菌數（Y）的影響。等高線圖越近似橢圓，表明各試驗因素間的交互作用越顯著；等高線的密集程度反映了響應面圖的平陡，響應面圖越陡，表明各試驗因素間的交互作用越顯著。在各個響應面圖中，酸馬乳中乳酸菌活菌數在試驗濃度范圍內均有最高點，通過Design-Expert 8.05對建立的回歸方程進行參數最優化分析，可以得出酸馬乳最優發酵條件為接種量5.56%（干酪乳桿菌∶乳酸乳球菌∶酵母菌=1∶1∶2），發酵溫度31.11℃，發酵時間48.18 h。在此條件下，酸馬乳中乳酸菌活菌數對數預測值為8.680 6。

2.2.3驗證試驗

為檢驗所建立的多元回歸模型的準確性，同時考慮試驗操作方便，將酸馬乳的最佳發酵條件修正為接種量6%（干酪乳桿菌∶乳酸乳球菌∶酵母菌=1∶1∶2），發酵溫度32℃，發酵時間48h，在該條件下進行3次酸馬乳發酵平行試驗，得到的酸馬乳中乳酸菌活菌數對數平均值為8.673 9，與預測值較為接近，說明該模型準確可靠，能較好地預測酸馬乳中乳酸菌活菌數。

2.3酸馬乳質量指標

2.3.1感官指標

在響應面優化的發酵工藝條件下獲得酸馬乳外觀呈均勻的乳白色，底部有少量蛋白質沉淀；乳香濃郁，有傳統發酵酸馬乳特征風味，無異味；口感清爽，有輕微殺口感。

2.3.2理化指標

酒精度1.1%vo1～1.6%vo1；總酸（以乳酸計）6.0～7.4g/L；還原糖（以葡萄糖計）45.0～60.0 g/L。

2.3.3微生物指標

乳酸菌活菌數：8.673 9 1gCFU/mL；大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌：均未檢出。

3　結論

試驗以酸馬乳中乳酸菌活菌數為響應值對酸馬乳的發酵條件進行了優化，通過單因素試驗以及Box-Behnken Design響應面優化建立了多元回歸模型，得到酸馬乳最優發酵條件為接種量6%，接種比例（干酪乳桿菌∶乳酸乳球菌∶酵母菌）=1∶1∶2，發酵溫度32℃，發酵時間48h，不添加蔗糖。在此條件下，酸馬乳中乳酸菌活菌數對數值可達到8.6739，酵母菌活菌數對數值為7.6284，酸度6.34 g/L，酒精度1.2%vo1。

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Optimization of fermentation process of koumiss by response surface methodo1ogy

ZHANG Yanan1，WANG Xiaobiao1，ZHANG Zhizhen2，WANG Wei1，WANG Pei1，WU Yun1*
（1.Co11ege of Food Sciences and Pharmaceutica1 Sciences，Xinjiang Agricu1tura1 University，Urumqi 830052，China；2.Co11ege of Science and Techno1ogy，Xinjiang Agricu1tura1 University，Urumqi 830052，China）

Using the viab1e counts of 1actic acid bacteria in koumiss as eva1uation index，the effect of different fermentation conditions on the viab1e counts of 1actic acid bacteria in koumiss was studied.On the basis of sing1e factor experiments，the fermentation condition was optimized by response surface methodo1ogy.The resu1ts indicated that the optima1 fermentation conditions of koumiss wereLactobaci11us casei，Lactococus 1actisand K1uyveromyces marxianusratio 1∶1∶2 inocu1um 6%，time 48 h，fermentation temperature 32℃，without sucrose addition.Under the optima1 conditions，the 1g va1ue of viab1e counts of 1actic acid bacteria and yeast cou1d reach up to 8.673 9 and 7.628 4，respective1y.The acidity of the product was 6.34 g/L，and the a1coho1 content was 1.2%vo1.

koumiss；1actic acid bacteria；yeast；fermentation process optimization

TS261.9

A

0254-5071（2015）12-0083-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.018

2015-09-10

新疆維吾爾自治區科技廳重大專項目（201130101-4（2）-2）；“十二五”國家科技支撐項目（2012BAD44B01-05）

張亞南（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

武運（1965-），女，教授，碩士，研究方向為食品生物技術。