黃傘胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

灑榮波，王　輝，鹿　慧，魏　梅，許盈盈，卜睿智（泰山醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271000）

黃傘胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

灑榮波，王輝，鹿慧，魏梅，許盈盈，卜睿智
（泰山醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271000）

采用P1ackett-Burman試驗設(shè)計篩選顯著影響多糖產(chǎn)量的培養(yǎng)條件，然后用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后通過Box-Behnken設(shè)計及響應(yīng)面分析確定主要影響因素的最佳值。結(jié)果表明，多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件為：初始pH值6.5、搖床轉(zhuǎn)速209 r/min、裝液量48 mL/250 mL、溫度31℃、接種量10%、種齡90 h、培養(yǎng)時間180 h。在此最佳條件下，黃傘發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量可達7.44 g/L，比優(yōu)化前提高了近2倍。利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化黃傘胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件是可靠的，具有實際的應(yīng)用價值。

黃傘；胞外多糖；培養(yǎng)條件優(yōu)化；響應(yīng)面分析

黃傘（Pho1iota adipose）又名柳蘑、黃蘑、多脂鱗傘，是一種食藥兼用真菌［1］。其在國外分布于歐洲、美國、日本等地，在我國分布于山東、河北、山西、吉林、浙江、河南等多個地區(qū)。黃傘富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及多種礦物質(zhì)元素，食之黏滑爽口，味道鮮美，風味獨特，營養(yǎng)豐富，民間用于治療腫瘤和肺疾［2］。近年來大量研究表明，黃傘多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫力［3-5］、抗腫瘤［6-8］、降血脂［9-10］、抗菌［11-12］等生物學(xué)活性，更多的生物學(xué)專家將黃傘的研究作為當前的熱點之一。

自然界黃傘子實體和人工栽培黃傘子實體由于周期長、產(chǎn)量低、成本較高，因而未得到全面開發(fā)。目前黃傘菌有效成分開發(fā)與應(yīng)用主要途徑是液態(tài)發(fā)酵法。為此，十分有必要對黃傘的深層發(fā)酵條件進行研究，以便用發(fā)酵液多糖代替子實體多糖作為食品、保健品或藥品的原料。惠豐立等［13］采用搖瓶培養(yǎng)法對黃傘菌絲深層發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了研究，運用正交試驗法初步得出黃傘菌絲深層發(fā)酵較佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件；賈永［14］也對黃傘深層培養(yǎng)條件進行了研究，但他們的研究中涉及到的碳源和氮源種類較少，對培養(yǎng)條件的研究也較單一，不夠系統(tǒng)，不能全面地反映黃傘的培養(yǎng)狀況和生物學(xué)特性。本研究采用響應(yīng)面分析法應(yīng)用Minitab 16和Design-Expert 8.0軟件，優(yōu)化了黃傘胞外多糖液體發(fā)酵的培養(yǎng)條件，以期為黃傘菌的大規(guī)模培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

黃傘（Pho1iota adiposa）：中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號5.625。

1.1.2化學(xué)試劑

馬鈴薯、麩皮、黃豆餅粉：市售。

葡萄糖、蛋白陳、KH2PO4、MgSO4、VB1、硫酸銨、瓊脂：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

①種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、麩皮2%、蛋白胨1%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、VB120 mg/L。

②發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%、麩皮2%、硫酸銨0.5%、黃豆餅粉1%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%。

1.2儀器與設(shè)備

BHC-1300無菌超凈工作臺：江蘇泰諾源生物技術(shù)有限公司；HZ-88搖床：常州普天儀器制造有限公司；TGL-20M高速臺式離心機：德國賽多利斯公司；pHS-3c型精密pH計：上海雷磁儀器廠；HHs型數(shù)顯恒溫水浴鍋、UV 1900型雙光束紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種活化

將保藏于4℃冰箱的黃傘菌種無菌接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板，28℃培養(yǎng)7 d，待菌絲長滿平板即可使用。

1.3.2搖瓶培養(yǎng)

搖瓶裝液量50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接入10%的種子液，在旋轉(zhuǎn)式搖床上轉(zhuǎn)速為200 r/min、28℃條件下培養(yǎng)10 d，即為黃傘菌液體培養(yǎng)發(fā)酵液。

1.3.3胞外多糖產(chǎn)量的測定

胞外多糖產(chǎn)量的測定參照文獻［15］進行。

1.3.4P1ackett-Burman試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，選取可能影響黃傘發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量的7個因素：初始pH值、溫度、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、種齡、培養(yǎng)時間，用P1ackett-Burman設(shè)計對上述的7個因素進行考察，以胞外多糖產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用Minitab16軟件進行試驗設(shè)計和結(jié)果分析，試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5最陡爬坡試驗

由P1ackett-Burman試驗篩選出影響黃傘胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素后，進行最陡爬坡試驗，使關(guān)鍵因素濃度最大限度靠近響應(yīng)值極大區(qū)，步長及變化方向根據(jù)P1ackett-Burman試驗結(jié)果得出。找出胞外多糖產(chǎn)量最高的發(fā)酵條件，即為響應(yīng)面分析的中心點。

1.3.6Box-Behnken設(shè)計

根據(jù)P1ackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗確定的試驗因素和水平，采用Box-Behnken試驗對黃傘胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件進行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗設(shè)計，采用Design-Expert 8.0軟件進行試驗設(shè)計和結(jié)果分析。試驗的因素與水平見表2。

表2　Box-Behnken試驗因素和水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2　結(jié)果與分析

2.1P1ackett-Burman試驗篩選主要影響因子［16］

在前期單因素試驗基礎(chǔ)上，選用N=12的P1ackett-Burman試驗設(shè)計，并預(yù)留3個空項作為誤差分析，對初始pH值（A）、溫度（B）、接種量（C）、搖床轉(zhuǎn)速（D）、裝液量（E）、種齡（F）和培養(yǎng)時間（G）7個因素進行考察，分別對應(yīng)于表中的7列，每個因素取高（1）、低（-1）兩個水平，高水平為低水平的1.25倍，響應(yīng)值為黃傘胞外多糖產(chǎn)量（Y），P1ackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)面結(jié)果如表3所示，各因素的顯著性及方差分析如表4所示。

表3　發(fā)酵條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments for fermentation conditions optimization

表4　Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments

從表4可以看出，黃傘發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖過程中，在α=0.05的顯著水平上，初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速和裝液量對多糖產(chǎn)量影響顯著，可作為主要因素進行下一步的響應(yīng)面試驗。其他因素的取值可以根據(jù)各因素效應(yīng)的正負和大小，正效應(yīng)的因素取較高值，負效應(yīng)的因素取較低值。

2.2最陡爬坡試驗結(jié)果

根據(jù)P1ackett-Burman試驗結(jié)果，以主效應(yīng)因素效應(yīng)值方向為爬坡方向，固定其他因素為溫度31℃、接種量10%、種齡90 h、培養(yǎng)時間180 h，確定初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速和裝液量為3個主要影響因素，試驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示。從表5可以看出，第3組胞外多糖產(chǎn)量最高，為5.19 g/L，因此以第3組的因素水平作為響應(yīng)面試驗的中心點，即初始pH 值6.0、搖床轉(zhuǎn)速210 r/min、裝液量47.5 mL/250 mL。

表5　最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3響應(yīng)面試驗優(yōu)化黃傘發(fā)酵培養(yǎng)條件

2.3.1Box-Benhnken試驗設(shè)計與分析

表6　Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

根據(jù)P1ackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗確定的因素與水平，采用Box-Benhnken試驗設(shè)計對黃傘發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件進行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，并對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值。以黃傘發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，以初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量為影響因子進行Box-Benhnken響應(yīng)面分析，試驗結(jié)果見表6。

2.3.2二次回歸模型擬合及方差分析

應(yīng)用Design Expert 8.0軟件對表6的實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，獲得黃傘胞外多糖產(chǎn)量對初始pH、搖床轉(zhuǎn)速和裝液量的二次多項式回歸方程為：

該二次多項模型及其各項的方差分析結(jié)果見表7。由表7可以看出，該模型的P值＜0.000 1，說明模型是極顯著的；決定系數(shù)R2為0.995 0，這表明99.50%的試驗數(shù)據(jù)可用此模型解釋，因此回歸方程擬合程度較好，其預(yù)測值與實驗值的相關(guān)性極顯著。失擬項P值為0.184 1＞0.05，說明該模型失擬不顯著。對回歸方程利用Design Expert 8.0軟件進行分析，得到模型的極值點，即初始pH為6.5、搖床轉(zhuǎn)速為209.2 r/min、裝液量為47.7 mL/250 mL時，黃傘胞外多糖產(chǎn)量最高，預(yù)測值達到7.84 g/L。為實際操作方便，黃傘胞外多糖發(fā)酵條件確定為初始pH 6.5、搖床轉(zhuǎn)速209 r/min、裝液量48 mL/250 mL。其他發(fā)酵條件為溫度31℃、接種量10%、種齡90 h、培養(yǎng)時間180 h。

表7　Box-Behnken試驗回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation for Box-Behnken experiments

由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合可以繪出響應(yīng)面圖形，結(jié)果見圖1。由圖1可知，搖床轉(zhuǎn)速、初始pH值、裝液量對多糖提取率的影響均呈拋物面型關(guān)系，且響應(yīng)面均存在一個極大值點。其中搖床轉(zhuǎn)速和初始pH值之間的交互作用最為顯著。

圖1　初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速和裝液量交互作用對胞外多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH，shaking speed and liquid volume on exopolysaccharide yield

2.4模型驗證試驗

按照優(yōu)化的黃傘發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件進行了驗證試驗，黃傘發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量分別為7.64 g/L、7.23 g/L、7.45 g/L，平均值為7.44 g/L，為預(yù)測值的94.9%，表明該模型能較好地預(yù)測實際發(fā)酵情況。

3　結(jié)論

本實驗經(jīng)P1ackett-Burman試驗確定初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量對黃傘發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量有顯著影響。采用響應(yīng)面分析方法，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗，用DesignExpert 8.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，得到黃傘發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量回歸模型，并取得了模型最優(yōu)值時各因素水平。結(jié)果表明，黃傘胞外多糖發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件為：初始pH值6.5、搖床轉(zhuǎn)速209 r/min、裝液量48 mL/250 mL，其他發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度31℃、接種量10%、種齡90 h、培養(yǎng)時間180 h。在試驗條件下，黃傘發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量可達7.44 g/L，比優(yōu)化前提高了近2倍。與惠豐立等［13］利用單因素和正交試驗進行的黃傘菌絲體多糖培養(yǎng)條件優(yōu)化的試驗相比效果更加明顯。同時，通過回歸方程得到的最大預(yù)測值與驗證試驗結(jié)果非常接近，說明利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化黃傘胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件是可靠的，具有實際的應(yīng)用價值。

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Optimization of fermentation conditions ofPho1iota adiposeexopo1ysaccharide by response surface methodo1ogy

SA Rongbo，WANG Hui，LU Hui，WEI Mei，XU Yingying，BU Ruizhi
（Schoo1 of Life Sciences，Taishan Medica1 University，Taian 271000，China）

P1ackett-Burman design was used to se1ect the fermentation conditions of significant impact on the po1ysaccharide yie1d，and then the path of steepest ascent was adopted to approach the optima1 region.Fina11y the optimum 1eve1s of the main inf1uencing factors were determined by Box-Behnken design and response surface ana1ysis.The resu1ts showed that the optimum fermentation conditions of exopo1ysaccharide were initia1 pH 6.5，shaking speed 209 r/min，1iquid vo1ume 48 m1/250 m1，temperature 31℃，inocu1um 10%，inocu1um age 90 h and cu1ture time 180 h.Under the optimum conditions，the yie1d ofPho1iota adiposeexopo1ysaccharide cou1d reach to 7.44 g/L，which was about 2 times than that of before the optimization.It was re1iab1e that the fermentation conditions ofP.adiposeexopo1ysaccharide were optimized by response surface ana1ysis，which had practica1 app1ication va1ue.

Pho1iota adipose；exopo1ysaccharide；fermentation conditions optimization；response surface ana1ysis

T992

A

0254-5071（2015）12-0069-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.015

2015-11-04

山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2012CL02）

灑榮波（1978-），男，副教授，博士研究生，主要從事微生物發(fā)酵及生物活性物質(zhì)應(yīng)用研究工作。