不同甜酒曲中可培養真菌的多樣性分析

姚淑敏，閆華文，陳　璐（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

不同甜酒曲中可培養真菌的多樣性分析

姚淑敏，閆華文，陳璐
（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

用可培養的方法對6種甜酒曲中的真菌進行分離篩選，共分離得到25株酵母菌和13株霉菌，利用26S rDNA序列分析對酵母菌進行鑒定，結果表明，其分屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibu1igera）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orienta1is）和克魯維畢赤酵母（Pichia k1uyveri）。利用ITS rDNA序列分析對霉菌菌株進行鑒定，結果表明，13株霉菌分別為米根霉（Rhizopus oryzae）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）、小孢根霉華變種（Rhizopus microsporusvar.chinesis）、小孢根霉須狀變種（Rhizopus microsporusvar.rhizopodiformis）、印度毛霉（Mucor indicus）和卷枝毛霉（Mucor circine11oides）。

可培養真菌；26S rDNA；ITS rDNA；甜酒曲

甜酒曲（甜酒藥）是發酵甜酒釀的發酵劑。我國用曲制酒工藝由來已久，并且影響深遠，日本學者坂口謹一郎先生將用曲制酒這一工藝與我國古代的四大發明相媲美［1］。最原始的甜酒曲一般以蒸煮的谷物以及各種輔料為主，添加辣蓼草，接種環境中的霉菌和酵母菌等多種微生物自然發酵而成［2-3］。隨著科技的進步，制曲工藝也進一步提升，可以人為的控制接種的菌種類別進而制得不同風味的甜酒釀。由于純種根霉曲和現代工業制曲菌種比較單一，因此性質穩定，制得酒釀質量穩定、口感單一；民間曲微生物種類繁多且不穩定，發酵的甜酒釀口感醇厚，風味獨特，酒味較為濃厚，但是由于性質不穩定，發酵工藝不便于控制，大批量發酵生產因此受到限制［4］。正是由于酒曲的種類不同進而導致了不同甜酒釀風味的差異，因此酒曲又被譽為“酒之骨”［5］。

在亞洲許多地區，用發酵劑來發酵酒精類飲料和相關食物已經具有多年歷史［6-7］，只是發酵劑的名稱因地而異，如印度的“Hamei”就是一種天然的起始發酵物，以糯米為原料，拌入“Hamei”發酵制得的酒精飲料酒類似于中國的米酒。除此之外，印度尼西亞的“Ragi”、錫金的“Macha”、韓國的“Nuruk”、菲律賓的“Budob”、坦桑尼亞的“Togwa”都與中國的甜酒曲類似［8］。

甜酒釀發酵不是一種微生物單獨起作用，實際上是多種菌群的混合發酵，發酵過程中存在菌相的變化。大量研究表明，酒曲中主要有三大類微生物：酵母菌，霉菌和細菌。其中霉菌主要包括根霉和毛霉兩個屬，霉菌主要產生淀粉酶和蛋白酶。甜酒曲中酵母菌包括釀酒酵母和非釀酒酵母，其中釀酒酵母是甜酒釀發酵過程中的優勢菌［9］，主要是利用糖進行酒精發酵［10］，此外扣囊復膜酵母、畢赤酵母、異常漢遜酵母以及其他的產酯酵母也起到了相當重要的作用。

寧浩等［11］對華中地區的發酵米酒進行研究，從中分離得到2株水解淀粉能力較強的霉菌和3株產酒精能力較強的酵母菌，并對其發酵能力及產酒精方面進行了初步研究。王艷萍等［12］對湖北荊州的甜酒曲中的微生物進行分離純化，得到1株霉菌，1株酵母菌和2株細菌，其中霉菌屬于毛霉科，毛霉屬。越南學者［13］從酒中分離鑒定出5株酵母菌和魯氏毛霉（Amy1omyces rouxii）、少孢根霉（Rhizopus o1igosporus）、米根霉（Rhizopus oryzae）等霉菌，而根霉在淀粉糖化過程中還可以產生淀粉葡萄糖苷酶。YANG S等［14］從韓國的39種Nuruk樣品進行研究，從中分離得到174株絲狀真菌。

本實驗通過對不同產地的酒曲中可培養真菌多樣性的研究來了解不同地區甜酒釀風味迥異的原因，對甜酒釀品質的進一步提高以及甜酒釀的深加工提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品采集

6種中國不同地區（湖南韶山、湖南湘潭、湖南祁東、福建、浙江麗水和浙江蘭溪）的甜酒曲樣品，分別標記為1#、2#、3#、4#、5#、6#。

1.1.2培養基［15］

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養基：葡萄糖1 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨1 g，瓊脂粉2 g，加蒸餾水定容至100 mL，自然pH；

YPD液體培養基：葡萄糖1 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨1 g，加蒸餾水定容至100 mL，自然pH；

沙氏固體培養基：葡萄糖（或麥芽糖）4 g，蛋白胨1 g，瓊脂粉2 g，加蒸餾水，定容至100 mL，自然pH；

沙氏液體培養基：葡萄糖（或麥芽糖）4 g，蛋白胨1 g，加蒸餾水，定容至100 mL，自然pH。

1.2儀器與設備

HNY-1102C恒溫培養振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；A300型ArtGeneTM基因擴增儀：杭州朗基科學儀器有限公司；DYY-6C瓊脂糖水平電泳板：北京六一儀器廠；Tanon 2500凝膠成像系統：上海天能科技有限公司。

1.3方法

1.3.1酒曲中可培養真菌的分離純化方法

梯度稀釋：取1g酒曲樣品，放入裝有99 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中，振蕩20～30 min，即得菌懸液，利用10倍稀釋法，獲得不同梯度濃度的稀釋菌懸液，用移液槍分別移取0.1 mL菌懸液于不同的YPD固體培養基和沙氏固體培養基上，用無菌涂布棒將其涂布均勻，分別做好標記，30℃培養，3～4 d后觀察并記錄結果。

1.3.2酵母菌和霉菌基因組DNA的提取方法

參考《分子克隆實驗指南》介紹的方法提取基因組DNA［16］。

1.3.3酵母菌26S rDNA片段擴增

以26S rRNA基因通用引物NL1和NL4為上下游引物，以提取的酵母菌基因組DNA為模板，進行26S rDNA片段聚合酶鏈式反應（po1ymerase chain reaction，PCR）。引物序列如下所示：

NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′

1.3.4霉菌ITS1-5.8S rDNA-ITS2擴增

以真菌rDNA-ITS的通用引物ITS1和ITS4作為序列擴增的上下游引物，以上述提取的霉菌基因組DNA為擴增模板，進行PCR擴增。通用引物序列如下所示：

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

1.3.5PCR擴增產物的檢測及測序

取5μLPCR擴增產物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。瓊脂糖凝膠濃度1%；電泳緩沖液：1×TAE；電泳條件：100V、40 min。通過凝膠成像系統觀察電泳結果，選取條帶較亮的樣品送至上海生物工程公司進行測序，將測序結果在美國國家生物技術信息中心（nationa1centerof biotechno1ogy information，NCBI）數據庫上進行比對分析，然后利用Mega5構建系統進化樹。

2　結果與分析

2.1可培養真菌的分離純化結果

經過稀釋涂布平板法對甜酒曲中的樣品進行分離純化，根據菌落特征不同和顯微鏡觀察結果，總共從6種樣品中分離得到25株酵母菌菌株和13株霉菌菌株。結果見表1、表2。光學顯微鏡觀察其生長形態，結果見圖1、圖2。

表1　酵母菌分離菌株來源及名稱Table 1 Source and name of yeast isolates

表2　霉菌分離菌株來源及名稱Table 2 Source and name of mould isolates

圖1　酵母菌細胞形態Fig.1 Cell morphology of yeasts

圖2　霉菌菌絲體形態Fig.2 Mycelium morphology of moulds

由圖1可知，所分離的25株酵母菌中A細胞球形，單細胞，個體較大；C細胞卵球形，單細胞，個體較大；P、FJ-J-2細胞卵球形，單細胞，個體較?。籌、ZJL-6、ZJL-11細胞球形，個體較大，分散；L、ZJL-4細胞球形，個體較大，幾個聚在一起；M、ZJL-3細胞球形，個體較小，幾個聚在一起。N、O、ZJL-2、ZJL-9、ZJL-12、ZJL-13細胞球形，個體較小，分散；R細胞絲狀，個體較細，分散；FJ-J-1、ZJL-10細胞卵球形，個體較大，幾個聚在一起；FJ-J-3細胞短桿狀，個體較大，幾個聚在一起；FJ-J-4、ZJL-8卵球形，個體較大，分散；FJ-J-5、ZJL-5細胞卵球形，個體較小，分散。

由圖2可知，A-2菌絲灰褐色，粗壯，有假根，有孢囊，產孢囊孢子，孢子橢圓形；HX-1菌絲灰褐色，纖細，有孢囊，有假根和匍匐菌絲，孢囊孢子繁殖，孢子近球形；HX-2菌絲灰色，纖細，有假根和匍匐菌絲，孢囊孢子繁殖，孢子近球形；HX-3菌絲褐色，較粗壯，有孢囊、假根和匍匐菌絲，孢子橢圓形，??；HX-5菌絲灰褐色，菌絲粗壯，有假根和匍匐菌絲，孢囊孢子繁殖，孢子小，橢圓形；HX-6菌絲粗壯，灰褐色，有假根和匍匐菌絲，孢囊孢子繁殖，孢子大，近球形；FJ-M-1菌絲白色，纖細，無假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢子小，球形；FJ-M-2菌絲灰褐色，纖細，有假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子橢球形；FJ-M-3菌絲灰白色，纖細，無假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子橢球形；FJ-M-4菌絲灰褐色，菌絲纖細，有假根，有孢囊，孢囊孢子近球形；FJ-M-5菌絲白色，較粗壯，無假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子小，橢球形；ZJR-1菌絲灰褐色，粗壯，有假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子球形；ZJR-2菌絲褐色，纖細，有假根和匍匐菌絲，有孢囊，孢囊孢子橢球形。

2.2酵母菌分子生物學鑒定結果

2.2.1酵母菌26S rDNA片段PCR擴增結果

以提取的酵母菌DNA為模板，以NL1和NL4為上、下游引物擴增26S rDNA片段，片段長度為600 bp左右，電泳圖如圖3～圖5。

圖3　1#、2#、3#甜酒曲酵母菌26S rDNA片段PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of the 26S rDNA segment of yeast strains isolated from samples 1#，2#，3#

由圖3可知，1#、2#、3#甜酒曲中分離得到的9株酵母菌，通過26SrDNA通用引物擴增，在600bp左右各有一條亮帶，證明PCR擴增成功。由圖4可知，4#甜酒曲酵母菌26SrDNA片段PCR擴增結果，在600 bp左右各有一條亮帶，證明PCR擴增成功。由圖5可知，5#甜酒曲酵母菌26S rDNA片段PCR擴增結果，在600bp左右各有一條亮帶，證明PCR擴增成功。

圖4　4#甜酒曲酵母菌26S rDNA片段PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification results of the 26S rDNA segment of yeast strains isolated from sample 4#

圖5　5#甜酒曲酵母菌26S rDNA片段PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification results of the 26S rDNA segment of yeast strains isolated from sample 5#

2.2.2目的片段測序、結果比對及系統進化樹的構建

PCR擴增片段送至上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序結果與NCBI數據庫中的序列進行B1ast比對分析，獲得的序列提交至NCBI的GenBank數據庫，獲得登錄號。比對結果及獲得的登錄號見表3。

由表3可知，1#甜酒曲中分離得到的菌株A與克魯維畢赤酵母LY9：AB499014.1相似度高達99%。從2#甜酒曲中分離得到的6株酵母菌中，菌株R和M分別與克魯維畢赤酵母CEC RCS-0-9：JX103190.1和LY9：AB499014.1達到高相似度＞98%，而菌株I、L、N、O分別與釀酒酵母屬的不同菌株相似度＞97%。3#甜酒曲中的菌株C和P分別與釀酒酵母JN7N-19：KC715802.1和克魯維畢赤酵母菌株LY9：AB499014.1相似度達99%和97%，利用軟件Mega5對這9株酵母菌構建的系統進化樹（圖6）。通過以上分析可知，從1#、2#、3#甜酒曲中分離得到的9株酵母菌分屬于釀酒酵母和克魯維畢赤酵母兩個類群，其中菌株A、P、R、M鑒定為克魯維畢赤酵母（Pichia k1uyveri），而菌株C、I、L、N、O鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisisiae）。

表3　酵母菌序列比對結果Table 3 Sequence alignment results of yeast

圖6　1#、2#、3#甜酒曲中9株酵母菌的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of nine yeasts isolated from samples 1#，2#，3#

4#甜酒曲中總共分離得到5株酵母菌，其中菌株FJ-J-1 和FJ-J-2分別與扣囊復膜酵母s-5b-2：HM107787.1和3-1Y： KF717372.1相似度達到99%，菌株FJ-J-3與東方伊薩酵母QDA2：EU585765.1相似度達99%，而菌株FJ-J-4和FJ-J-5與不同的釀酒酵母菌株達到高相似度。利用軟件Mega5對4#甜酒曲的酵母菌構建的系統進化樹（圖7）。因此可以看出通過可培養的方法進行菌株篩選，從4#甜酒曲中分離到的5株酵母菌分屬于扣囊復膜酵母、東方伊薩酵母和釀酒酵母三個類群。

圖7　4#甜酒曲中5株酵母菌的系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of five yeasts isolated from sample 4#

5#甜酒曲中分離得到的11株酵母菌通過B1ast比對發現，11株酵母分離菌株與不同的釀酒酵母菌株的相似度達到97%以上，其中菌株ZJL-11與菌株JM2：JX867131.1相似度達100%，利用軟件Mega5對5#甜酒曲的酵母菌構建系統進化樹（圖8），結果表明，5#甜酒曲中的優勢菌群為釀酒酵母。

圖8　5#甜酒曲11株酵母菌的系統進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of 11 yeasts isolated from sample 5#

2.3霉菌分子生物學鑒定結果

2.3.1霉菌ITS片段PCR擴增結果

以霉菌DNA基因組DNA為模板，ITS1和ITS4為上、下游引物擴增霉菌ITS基因片段，片段長度為650 bp左右，電泳圖如圖9所示。

圖9　霉菌ITS PCR擴增電泳圖Fig.9 Amplification electrophoresis figure of mould ITS rDNA

由圖9可知，所分離的霉菌的ITS PCR擴增結果，在650 bp左右各有一條亮帶，證明PCR擴增成功。

2.3.2目的片段測序、結果比對及系統進化樹的構建

PCR擴增片段送至上海生物工程有限公司進行測序，將測序結果與NCBI數據庫中的已知序列進行B1ast比對分析，挑選與之相似度≥97%的菌株，獲得的序列提交至NCBI的GenBank數據庫，獲得登錄號。序列比對結果及獲得的登錄號如表4。

表4　霉菌ITS序列比對結果Table 4 Comparison results of mould ITS rDNA sequence

通過序列比對結果發現，分離得到的13株霉菌為根霉屬和毛霉屬，屬于6個不同的種，分別為：卷枝毛霉（Mucor circine11oides）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）、小孢根霉華變種（Rhizopus microsporusvar.chinensis）、小孢根霉須狀變種（Rhizopus microsporusvar.rhizopodiformis）、米根霉（Rhizopus oryzae）和印度毛霉（Mucor indicus），其中1#甜酒曲中分離得到的A-2與米根霉菌株VPCI66/P/10相似度達到99%。3#甜酒曲分離得到的5株霉菌經過序列比對分析發現均與小孢根霉須狀變種的不同菌株相似度高達99%。從4#甜酒曲樣品中分離得到的霉菌種類最多，FJ-M-1與卷枝毛霉菌株Bam1相似度達99%，FJ-M-2與小孢根霉菌株BS-A9相似度較高，FJ-M-3和FJ-M-5分別與印度毛霉的不同菌株相似度達到99%，FJ-M-4則與米根霉菌株VPCI66/p/11相似度達到99%。5#甜酒曲中分離得到的兩株霉菌均為根霉屬，ZJR-1和ZJR-2分別與小孢根霉菌株US-A2和小孢根霉華變種相似度達到99%。挑選相似度較高的已知菌株序列構建系統進化樹，結果見圖10。

圖10　霉菌ITS片段構建系統進化樹Fig.10 Phylogenetic tree of mould isolates based on ITS fragment

通過以上分析結果可以得出，得到的13株霉菌中，菌株A-2和FJ-M-4為米根霉，菌株HX-1、HX-2、HX-3、HX-5、HX-6為小孢根霉須狀變種，菌株ZJR-2為小孢根霉華變種，ZJR-1和FJ-M-2為小孢根霉，菌株FJ-M-3和FJ-M-5為印度毛霉，而菌株FJ-M-1鑒定為卷枝毛霉。

3　結論

實驗利用傳統的稀釋涂布法成功完成了甜酒曲中可培養真菌的分離純化，并利用26S rDNA序列分析對酵母菌分離株進行鑒定，利用ITS序列對分離霉菌進行了鑒定，從結果可以看出，在不同的甜酒曲中含有的酵母菌和霉菌有相同的菌株也有不同的菌株，這些不同的菌株在不同種類的甜酒曲樣品中，用于發酵產乙醇和有機酸及芳香物質等其他營養物質的不同，從而導致了甜酒釀的風味和營養成分存在差異，這也是不同地區甜酒釀的風味迥異的根本原因所在。對甜酒曲中的分離菌株進行條件優化，從而得到性能良好的菌株是提高甜酒釀品質的一條有效途徑。在接下來的實驗中，將對不同酒釀中的以營養成分進行進一步的研究。

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Diversity of cu1turab1e fungi in different sweet a1coho1ic drink's starters

YAO Shumin，YAN Huawen，CHEN Lu （Co11ege of Life Science，Qu Fu Norma1 University，Qufu 273165，China）

The 25 yeast strains and 13 mou1d strains were screened and iso1ated from the six kinds of sweet a1coho1ic drink's starters by cu1ture media methods，and the yeast strains were identified by 26S rDNA sequence.The resu1ts showed that the yeast strains be1ong to four groups:Saccharomyces cerevisiae，Saccharomyces fibu1igera，Issatchenkia orienta1isandPichia k1uyveri.The mou1d strains were identified by the ITS rDNA sequence，and resu1ts indicated that the 13 mou1d strains were identified asRhizopus oryzae，Rhizopus microsporus，Rhizopus microsporusvar.chinesis，Rhizopus microsporusvar.rhizopodiformis，Mucor indicusandMucor circine11oides.

cu1turab1e fungi；26S rDNA；ITS rDNA；sweet a1coho1ic drink's starters

TS261.1

A

0254-5071（2015）12-0048-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.011

2015-10-01

山東省青年基金資助項目（ZR2013EEQ009），曲阜師范大學實驗室開放基金項目（sk201407）

姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向為微生物資源和利用。