外周血T淋巴細胞亞群變化與慢性丙型肝炎抗病毒應答的相關性

俞海英 王松 郭銀燕 丁巧云 潘劍 張小玉 曹興國 楊永峰

·臨床與基礎研究·

外周血T淋巴細胞亞群變化與慢性丙型肝炎抗病毒應答的相關性

俞海英 王松 郭銀燕 丁巧云 潘劍 張小玉 曹興國 楊永峰

目的探討慢性丙型肝炎（CHC）患者外周血T淋巴細胞亞群與臨床預后的相關性。方法采用流式細胞儀檢測34例CHC患者抗病毒治療前后及30例健康對照者CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量，CHC患者與健康人外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量差異及其抗病毒治療前后的變化，分析其在抗病毒療程及隨訪中的變化與臨床預后的相關性。結果CHC組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量均明顯低于健康對照組（P＜0.01）；CHC組抗病毒治療后出現病毒學應答的患者外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量均明顯高于應答不佳者（P＜0.01）；停用干擾素1年后沒有復發的患者CD3+CD8+T淋巴細胞數明顯高于復發的患者（P＜0.01），而CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞絕對計數無明顯升高（P＞0.05）。結論檢測CHC患者外周血T淋巴細胞亞群變化可作為預測患者抗病毒應答及應答后復發的指標之一。

T細胞亞群；慢性丙型肝炎；流式細胞術

慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）治療的目的是病毒清除，目前干擾素（IFN）加利巴韋林聯合抗病毒被應用于CHC治療中；在此過程中，患者能否取得完全應答及取得應答后是否會復發，一直是臨床醫師關注的問題，與患者的切身利益也緊密相關。本文通過測定CHC患者抗病毒前后及隨訪中的外周血T淋巴細胞亞群數量變化，探討其與CHC患者抗病毒應答及應答后復發的關系。

資料和方法

一、病例選擇

選取東南大學附屬第二醫院2008年1月至2012年12月門診和住院，且臨床資料完整的34例CHC患者作為研究對象，其中男20例，女14例，年齡29～58歲，平均（39.2±8.9）歲。入選條件：①明確診斷為CHC，排除其他嗜肝病毒重疊感染；②患者均為轉氨酶持續或反復異常超過6個月，2×正常值上限（ULN）≤ALT＜10×ULN，TBil＜2×ULN；③抗HCV與HCV RNA陽性均超過6個月；④排除遺傳代謝性疾?。ú檠?、血脂、銅氧化酶）、自身免疫性疾?。ú樽陨砻庖呖贵w、甲狀腺功能）、藥物性肝炎（治療前無用藥史）及中毒性肝病（無發熱及毒物接觸史）。同時選取30例我院健康體檢者為對照組，性別、年齡構成與CHC組差異無統計學意義（P＞0.05）。診斷均符合2004年發布《丙型肝炎防治指南》及中華醫學會肝病學分會、中華醫學會感染病學分會頒布的2005版和2010版病毒性肝炎防治指南［1-3］。

二、標本采集與測定

治療前所有患者采用美國雅培定量檢測HBV血清學標志物，ELISA法檢測甲、丙、丁、戊型肝炎病毒以及EB病毒、巨細胞病毒標志物，熒光PCR法定量檢測HCV RNA。全自動生物化學儀定期檢測肝功能、腎功能，常規檢測凝血功能及血常規。

三、淋巴細胞亞群的檢測儀器設備及試劑

流式細胞儀為美國BD公司的FACSCalibur型；EDTA.K2抗凝管為美國BD公司產品；CD4、CD8等各種熒光標記單克隆抗體為美國Beckman Coulter公司產品。在含有已知數量標準微球的TruCOUNT管中加入20μL TriTEST CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP抗體和50μL抗凝血，充分混勻，室溫暗處反應15 min后，加入450μL FACS溶血素，充分混勻，室溫暗處反應15 min后24 h內流式細胞儀FACScalibur進行分析，試劑及儀器均購自美國BD公司。用CaliBRITETM磁珠及FACSComp TM軟件校準儀器，MultiSETTM軟件獲取數據并分析檢測結果，報告T細胞絕對值及各亞群百分率（%）。

四、治療方法

所有患者根據體重，予聚乙二醇干擾素（佩樂能80μg/支，默沙東公司）每周1次，皮下注射聯合利巴韋林≥10.6 mg/（kg·d），分3次口服，療程參照丙型肝炎防治指南執行：①非基因1型HCV RNA低于檢測水平和肝功能正常，6個月停藥，如HCV RNA陽性，繼續治療，總療程12個月。②基因1型HCV RNA低于檢測水平和肝功能正常，12個月停藥，總療程12個月。

五、觀察指標

IFN治療后HCV RNA無應答定義：患者使用聚乙二醇干擾素α（Peg-IFN）6個月，HCV RNA較基線下降≤1.0×101IU/m L。HCV RNA＜5.0×102IU/ m L為陰轉；HCV RNA陰轉為有效。治療中HCV RNA陰轉后又陽轉為反彈；治療有效停藥后HCV RNA陽轉為復發。

六、統計學處理

將隨訪資料用Excel軟件建立數據庫，使用SPSS 19.0統計軟件，計量資料采用F檢驗，計數資料采用χ2檢驗或u檢驗。

結 果

一、34例CHC患者治療前基因分型、HCV RNA、ALT及AST

基因1b型14例，Ic型2例；2a型4例，2b型4例；3a型3例，3b型1例；混合1b和2a型6例?；€HCV RNA定量（log）7.12±2.06 IU/m L，ALT134.28±75.26 IU/L，AST 67.47±44.65 IU/L。

二、CHC組與正常對照組CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數和百分數（見表1）

CHC組與正常對照組相比CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；CD3+CD4+T淋巴細胞百分數明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

三、CHC組治療前后外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數和百分數（見表2）

IFN治療后CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞絕對計數明顯升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；CD3+CD8+T升高有統計學意義P＜0.05。

四、停藥后1年隨訪陰轉與復發患者外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量變化（見表3）

陰轉組CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數明顯升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。復發組CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數有升高，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞絕對計數無明顯升高，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量（個/μL±s）和百分數變化（%±s）

表1 各組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量（個/μL±s）和百分數變化（%±s）

組別 正常對照組 慢性丙型肝炎組 t值 P值32 34 CD3+數量個/μL 1400.86±299.26 793.90±119.90 5.01 ＜0.01百分數% 78.37±13.61 69.7±10.11 2.91 ＜0.01 CD3+CD4+數量個/μL 715.65±106.20 396.90±62.10 6.93 ＜0.01百分數% 58.82±7.53 50.22±7.28 2.2 ＜0.05 CD3+CD8+數量個/μL 645.43±99.32 310.45±48.87 8.08 ＜0.01百分數% 30±4.68 27.91±4.07 1.29 ＞0.例數05

表2 治療前后外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量（個/μL±s）和百分數變化（%±s）

表2 治療前后外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量（個/μL±s）和百分數變化（%±s）

組別 治療前 治療后 t值P值34 34 CD3+數量個/μL 793.90±119.90 1235.57±142.10 6.37 ＜0.01百分數% 69.7±10.11 82.25±8.62 2.61 ＜0.01 CD3+CD4+數量個/μL 396.90±62.10 815.85±118.22 8.38 ＜0.01百分數% 50.22±7.28 58.82±6.65 2.34 ＜0.05 CD3+CD8+數量個/μl 310.45±48.87 371.21±52.42 2.28 ＜0.05百分數% 27.91±4.07 30.98±4.35 1.36 ＞0.例數05

表3 陰轉組與復發組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量（個/μL±s）

表3 陰轉組與復發組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數量（個/μL±s）

CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+88后855.24±128.69 492.50±64.09 522.41±74.23 205.25±28.03 1425.75±20.46 1155.00±195.67 t值 3.94 0.66 6.03 4.63 7.20 1.90 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.陰轉組 復發組前625.00±88.36 470.12±62.83 311.44±57.06 294.00±43.56 1038.11±142.22 980.00±148.陰轉組 復發組 陰轉組 復發組05

討 論

本研究結果34例患者以基因1型為多，其次為基因2型、3型，混合型最少，不同基因型對IFN治療反應不同，在一定意義上決定著丙型肝炎病毒感染不同的發展和結局，因此療程需個體化。外周血T淋巴細胞亞群的數量（CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T）是反映機體細胞免疫狀態的重要指標，當T淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常時，可導致免疫功能紊亂而發生HCV感染［4］。本研究表明，在CHC患者中CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數較正常對照組明顯降低，與T細胞亞群的紊亂導致CD8+T細胞中的細胞毒T細胞（CTL）損傷肝細胞及CD8+T細胞中的Ts抑制CD4+T細胞，引起CD4+T輔助清除病毒能力下降有關，這兩方面互為因果，使機體參加免疫反應的免疫活性細胞不足，發生HCV感染。在丙型肝炎發病中細胞免疫反應起重要作用，CTL特異攻擊HCV感染的靶細胞，可引起肝細胞損傷［5］，而T細胞免疫紊亂如何在CHC的病理損傷中發揮作用則是一個復雜的過程［6］。慢性HCV感染的治療主要靠IFNα，其通過調節細胞免疫功能，改善機體的免疫狀態［7］，有利于CHC患者清除HCV，從而減輕肝臟組織炎癥及纖維化。Peg-IFN的使用提高了干擾素的療效，本研究中Peg-IFN治療后外周血總T淋巴細胞及CD4+、CD8+T細胞明顯高于治療前，與IFNα誘導T細胞產生淋巴因子，外周血T淋巴細胞及亞群CD4+、CD8+活化增多，CD4+T細胞與CD8+T細胞比例得到平衡，增強輔助性T細胞亞群1（Th1）細胞功能有關。CHC患者體內亦存在針對HCV結構蛋白及非結構蛋白的CTL應答，肝臟內HCV特異性CTL應答的頻率遠高于外周血循環的CTL應答，提示肝臟內CTL應答在抵抗HCV感染中的重要作用。使用更精確的HCV抗原與主要組織相容性復合體（MHC）I類分子四聚體相結合的體外直接分析法證明，CHC患者體內CTL應答為外周血CTL應答的30倍，提示多數HCV特異性CD8+T細胞可聚集在肝內發揮有效的抗HCV CTL應答。有報道提示，CHC患者HCV含量與HCV特異性CTL應答范圍及程度呈正相關。通過直接的細胞溶解或細胞因子介導的機制，有效的CTL應答可導致病毒清除［8］。經Peg-IFN治療后，外周血總T淋巴細胞及CD4+、CD8+T細胞明顯升高，對清除病毒起到積極作用。進一步觀察CHC患者外周血T淋巴細胞及亞群，發現停用IFN 1年后沒有復發的患者CD4+T細胞數明顯高于復發的患者，復發的患者治療后CD3+、CD3+CD4T淋巴細胞絕對計數無明顯升高，可能HCV特異性的CD4+應答是保護宿主的重要部分，缺乏CD4+應答時，HCV特異性的CTL記憶功能不能維持。CHC患者CD4+應答常表現為緩慢、低下、而且短暫，低弱而持續的HCV CTL應答不能有效清除HCV感染，但可導致持續的肝臟損傷。研究顯示，CHC患者體內有效的HCV核心蛋白特異的CD4+應答與肝臟損傷及疾病活動性的有效控制密切相關，HCV特異性CD4+應答可能參與控制HCV感染。因此檢測CHC患者外周血T淋巴細胞亞群變化可作為預測患者抗病毒應答及應答后復發的指標之一。

1 中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案.中華傳染病雜志，2001，19：56-62.

2 中華醫學會肝病學分會，中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會.丙型肝炎防治指南.中華傳染病雜志，2004，22：131-136.

3 中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會，慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.中華傳染病雜志，2011，29：65-80.

4 周光炎.免疫學原理.上海：上?？茖W技術出版社，2007，251-252.

5 Stoop JN，Van der Modon RG，Kuipers EJ，et al.Inhibition of viral replication reduces regulatory T cells and enhances the antiviral immune response in chronic hepatitis.Virolong，2007，36：141-148.

6 權啟鎮，孫自勤，王要軍.新肝臟病學.濟南：山東科學技術出版社，2002，200-201.

7 Samuel CE.Antiviral actions of interferons.Clin Microbiol Rev，2001，14：778-809.

2014-11-07）

（本文編輯：易玲）

210003 江蘇南京 東南大學附屬第二醫院肝病科

楊永峰，Email：yyf1997@163.com