HBV臨床分離株復制型質粒的構建與鑒定

李瑞明 楊燕 劉莉 萬松 賀昱霖 孟忠吉

·論 著·

HBV臨床分離株復制型質粒的構建與鑒定

李瑞明 楊燕 劉莉 萬松 賀昱霖 孟忠吉

目的克隆HBV臨床分離株全長基因組，構建真核表達復制載體，為研究HBV的耐藥機制提供基礎。方法從乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA，PCR擴增HBV全長基因組，經SapI酶切后，克隆入p HY106載體，測序分析序列，然后用lipofectamine 2000將重組載體轉染Huh7細胞，3 d后收集培養上清液，ELISA檢測HBs Ag、HBeAg水平；Real-time PCR檢測細胞培養上清液中HBV含量；Southern印跡檢測細胞內HBV復制中間體。結果獲得5株HBV臨床分離株均為野生型，其中基因B型3株，基因C型2株。成功構建5株HBV臨床分離株的復制型質粒，在轉染Huh7細胞的上清液中檢測到HBs Ag、HBeAg及HBV DNA，細胞內檢測到HBV復制中間體。結論成功克隆并構建了HBV臨床分離株復制型質粒，這種復制型質粒將在HBV臨床分離株的耐藥機制和藥物敏感性等方面研究中發揮重要作用。

乙型肝炎病毒；臨床分離株；重組體

HBV感染嚴重威脅人類的健康，我國現有慢性HBV感染者約9 300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬例［1］。核苷（酸）類似物已廣泛應用于治療乙型肝炎，大多數患者需要長期治療甚至終身治療，但是隨著治療時間的延長，產生HBV突變，耐藥風險增加［2］，LAM耐藥后會降低病毒對其他藥物的敏感性，且rt A181T/sW172突變會增加肝癌的風險［3］。因此有必要建立HBV體外復制表達系統，研究HBV的耐藥機制，并針對不同患者體外篩選有效的抗HBV藥物。本研究建立了HBV臨床分離株全長基因組的克隆方法，構建了真核表達復制載體，并成功在真核細胞中產生子代病毒，以期為進一步研究HBV的耐藥機制及檢測治療提供技術平臺。

材料和方法

一、實驗材料

采集湖北十堰市太和醫院住院乙型肝炎患者血清標本3 m L于促凝管，分離血清，分裝保存于-20℃備用。

PCR擴增儀（美國Bio-Rad）；酶標儀（德國Thermo Scientific Multiskan FC），定量PCR儀（美國ABI StepOnePlus）；限制性內切酶SapI及T4 DNA連接酶購自美國New England Biolabs公司；高保真Taq DNA聚合酶購自羅氏公司；DMEM 培養基、脂質體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Hyclone；DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、定量PCR試劑盒購自北京天根；HBsAg、HBeAg、ELISA檢測試劑盒購自北京科美公司。

質粒p HYl06及p HYl06-WTA由德國埃森大學病毒學研究所陸蒙吉教授提供；大腸桿菌DH5a感受態購自天根。

人肝癌細胞系Huh7為本室保存。復蘇后培養于含10%胎牛血清基礎培養液（FBS MEM）培養基。

二、方法

（一）引物設計 參照Günther等［4］HBV全長引物序列設計合成。引物序列P1（nt1821-1843）：5′CCGGAAAGCTTATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC3′，P2（nt1825-1804）：5′CCGGAGAGCTCATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG3′。鑒定引物序列：CMV Forward Primer：5′GACGCAAATGGGCGGTAG 3′，HY130：5′GGA AAC AGC TAT GAC CAT G3′。

（二）HBV DNA抽提 血清和細胞培養上清液中的HBV DNA的抽提，參照天根DP316 DNA提取試劑盒操作，其中細胞培養上清液中HBV抽提前先加入2μL 1 mol MgCl2和2μL 10 mg/mL DNase I，37℃處理30 min。最后用30μL dd H2O洗脫DNA備用。

（三）HBV全長基因組的擴增與檢測 取2μL HBV DNA為模板，引物P1、P2各1.5μL，參照Roche高保真試劑盒說明配制反應體系，參照Durantel等［5］的HBV全長PCR參數，擴增HBV全長基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。

（四）HBV復制型質粒p HY106-HBV的構建PCR產物經純化試劑盒純化后與真核表達載體p HYl06各2μg分別用限制性內切酶Sap I于37℃酶切4 h，回收酶切產物和線性化p HY106載體，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產物轉化DH5a感受態細菌，在Amp抗性平板上篩選陽性克隆。挑取陽性克隆做菌落PCR，引物CMV Forward Primer（5′CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3′）和Hy130（5′GGAAACAGCTATGACCATG 3′），0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物，選取陽性菌落培養過夜抽提質粒測序鑒定。

（五）Huh7細胞的培養和轉染 Huh7細胞用含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素的DMEM培養液，在37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中培養。細胞轉染參照Lipofectamine 2000說明書進行。

（六）HBs Ag和HBe Ag的酶聯免疫吸附檢測培養上清中的HBs Ag和HBeAg水平采用ELISA試劑盒檢測參照說明書進行。

（七）HBV DNA檢測 抽提DNA，實時PCR檢測HBV DNA水平。94℃預變性2 min，40個循環；94℃變性15 s，60℃退火延伸15 s。上下游引物：5′TTGATGATCCTGGAA 3′、5′TGCTATGCCTCATCT 3′。

（八）核衣殼相關HBV復制中間體的提取和Southern雜交 核衣殼相關HBV復制中間體的提取參考文獻［6］。核衣殼相關HBV復制中間體以1.0%的瓊脂糖凝膠分離，然后于轉移緩沖液中轉印到GeneScreenPlus尼龍膜上，與DIG標記的HBV全長探針雜交，采用成像系統分析雜交信號。

結 果

一、HBV臨床分離株的全長克隆

5例血清樣本中抽提的HBV DNA經PCR擴增，均獲得長約3.2 kb的產物，并順利克隆入p HY106載體，分別命名為p HY106-XJH、p HY106-LFR、p HY106-WSQ、p HY106-LYG和p HY106-MRG。經測序比對均為野生型全長HBV基因組，5株HBV序列已提交到GeneBank，序列號分別為：KM213037.1、KM213033.1、KM213032.1、KM213035.1和KM213034.1。其中3株為基因B型，2株為基因C型。

二、HBV復制性克隆在Huh7細胞中表達HBs Ag和HBe Ag

p HY106-XJH、p HY106-LFR、p HY106-WSQ、p HY106-LYG和p HY106-MRG質粒轉染Huh7細胞，72 h ELISA檢測細胞培養上清液中的HBs Ag和HBe Ag水平，結果5個復制性克隆轉染的Huh7細胞上清均可檢測到HBs Ag和HBe Ag的表達，其中p HY106-LYG和p HY106-MRG表達的HBs Ag與p HY106-WTA水平相當，p HY106-XJH、p HY106-LFR和p HY106-WSQ表達的HBsAg水平較低，所有質粒表達的HBe Ag水平均較低（圖1）。

圖1 Huh7細胞上清液中HBs Ag和HBeAg的表達

三、HBV復制型克隆在Huh7細胞中產生HBV子代病毒分泌到上清中

HBV復制型質粒（p HY106-XJH、p HY106-LFR、p HY106-WSQ、p HY106-LYG和p HY106-MRG）轉染Huh7細胞，72 h檢測細胞培養上清液中的HBV DNA水平，結果5個復制性克隆轉染的Huh7細胞上清液中均可檢測到高水平（107～109拷貝/m L）HBV DNA（圖2）。

圖2 Huh7細胞培養上清液中HBV DNA復制水平

四、HBV復制型克隆在Huh7細胞內產生DNA復制中間體

HBV復制型質粒（p HY106-XJH、p HY106-LFR、 p HY106-WSQ、p HY106-LYG和p HY106-MRG）轉染Huh7細胞，72 h Southern印跡檢測核心顆粒相關HBV DNA，結果5個復制性克隆轉染的Huh7細胞內均可檢測到HBV復制中間體，但復制水平明顯低于p HY106-WTA（圖3）

圖3 Huh7細胞內HBV的復制

討 論

HBV的基因組由環狀的部分雙螺旋結構構成，長約3.2 kb。其中的2/3為雙螺旋結構，1/3為單鏈。長鏈為負鏈，短鏈為正鏈。長鏈的5'端與3'端無共價連接，而是與一種蛋白質共價相連。長鏈的5'端以250～300對堿基互補結合。短鏈的長度視病毒而異，一般長約1.6～2.8 kb，約為長鏈的2/3［7］。Günther等［4］通過在負鏈末端缺口區兩側設計引物，使PCR的延伸避免跨越負鏈末端缺口，大大提高了HBV全長基因組的擴增效率。

p HY106載體由Yang等［8］構建，含HBV poly（A）尾，高度保守，用Günther方法擴增出臨床全長HBV基因序列用Sap I酶切，插入p HY106載體成為HBV復制子，包含 HBV復制最小必須序列。p HY106的結構確保HBV在插入p HYl06載體后能在巨細胞病毒啟動子作用下轉錄完整的前基因組RNA。

我們選用了Sap I內切酶直接酶切PCR產物和p HY106載體，成功構建了5個HBV臨床病毒株可復制型克隆。5個HBV臨床病毒株中B亞型有3例、C亞型有2例。所有克隆在轉染3 d后都檢測到了HBs Ag和HBe Ag的表達，其中HBs Ag的表達水平遠高于HBe Ag。B亞型的HBs Ag表達高于C亞型，但C亞型的HBeAg高于B亞型。這與B、C亞型的臨床表現的差異性相符［9-11］。Realtime PCR結果顯示B亞型的病毒含量遠高于C亞型，這與HBs Ag表達相似，提示HBs Ag表達強度與病毒含量成正比。在第3天B亞型的病毒量已經達到108數量級，C亞型也達到了106數量級。

本研究構建的HBV臨床病毒株可復制型克隆在細胞內能夠進行高水平復制，并且表達較高水平的HBs Ag和HBe Ag。B和C亞型的HBV是中國人群感染的主要基因型。這為進一步研究HBV的結構與功能、基因表達與調控，以及體外篩選抗HBV藥物等提供了一個很好的技術平臺。

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2 Bang KB，Kim HJ.Management of antiviral drug resistance in chronic hepatitis B.World J Gastroenterol，2014，20：11641-11649.

3 Yeh CT，Chen T，Hsu CW，et al.Emergence of the rt A181T/ sW172*mutant increased the risk of hepatoma occurrence in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B.BMC Cancer，2011，11：398.

4 Günther S，Li BC，Miska S，et al.A novel method for efficient amplification of whole hepatitis B virus genomes permits rapid functional analysis and reveals deletion mutants in immunosuppressed patients.J Virol，1995，69：5437-5444.

5 Durantel D，Carrouee-Durantel S，Werle-Lapostolle B，et al.A new strategy for studying in vitro the drug susceptibility of clinical isolates of human hepatitis B virus.Hepatology，2004，40：855-864.

6 Meng Z，Xu Y，Wu J，et al.Inhibition of hepatitis B virus gene expression and replication by endoribonuclease-prepared siRNA.J Virol Methods，2008，150：27-33.

7 Burda MR，Günther S，Dandri M，et al.Structural and functional heterogeneity of naturally occurring hepatitis B virus variants.Antiviral Res，2001，52：125-138.

8 Yang H，Westland C，Xiong S，et al.In vitro antiviral susceptibility of full-length clinical hepatitis B virus isolates cloned with a novel expression vector.Antiviral Res，2004，61：27-36.

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10 Sumi H，Yokosuka O，Seki N，et al.Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease.Hepatology，2003，37：19-26.

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Construction and identification of plasmids containing a replication-competent HBV supergenomic DNA derived from patients with chronic HBV infection

LI Rui-ming，YANG Yan，LIU Li，WAN Song，HE Yu-lin，MENG Zhong-ji.

（Institute of Biomedicine，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China；Research Center of Experimental Medicine，Tongji Hospital of Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

MENG Zhong-ji，Email：zhongji.meng@163.com

ObjectiveTo amplify full length hepatitis B virus（HBV）genome derived from patients with chronic HBV infection，and construct plasmids containing a replication-competent HBV supergenomic DNA.MethodsFull-length HBV genomes were purified from serum of chronic hepatitis B（CHB）patients，and amplified by high fidelity polymerase chain reaction（PCR），The PCR products were then restricted with Sap I and ligated with Sap I-linerized p HY106 plasmid，constructs of which were sequenced and transfected into Huh7 cells.Enzyme-linked immunosorbent assay，real-time PCR，and Southern blot，were performent to investigate the HBV gene expression and replication respectively.ResultsFive HBV wild type isolates（3 of genotype B and 2 of genotype C），denived from CHB patients，were amplified successfully，corresponding replication competent plasmids of which were constructed.In the recombinants-transfected Huh7 cells，high HBV DNA load，and high levels of HBs Ag，and HBeAg were detected in the supernatants，and HBV core associated replicative intermediates were verified.ConclusionThe construction of replication competent plasmids for HBV isolates from CHB patients will play an important roles in the detection and mechanism research for HBV mutation，as well as salvage therapy for patient infected with nucleos（t）ide analogues-associated mutants.

Hepatitis B virus；Clinical isolates；Recombinant

2014-12-15）

（本文編輯：錢燕）

湖北省教育廳重大項目（Z20102101），吳階平基金（2010B10），湖北省自然科學基金（2014CFB645，2010CDZ036）

442000湖北十堰，十堰市太和醫院生物醫學研究所（李瑞明，劉莉，萬松，賀昱霖，孟忠吉）；華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院實驗醫學研究中心（楊燕）

孟忠吉，Email：zhongji.meng@163.com