檜木醇誘導人腎透明細胞癌786-O細胞凋亡及其機制研究*

倪曉辰　趙志紅　馬永良　任宗濤　劉　彬　樊　博　衛書飛　張愛莉

·基礎研究·

檜木醇誘導人腎透明細胞癌786-O細胞凋亡及其機制研究*

倪曉辰趙志紅馬永良任宗濤劉彬樊博衛書飛張愛莉

目的：探討檜木醇（hinokitiol）對人腎透明細胞癌786-O細胞株的增殖抑制作用及誘導凋亡效應，初步闡明其機制。方法：采用CCK-8法檢測檜木醇對腎癌786-O細胞增殖的抑制作用；流式細胞術檢測細胞凋亡情況；轉染EGFP-LC3后鏡下觀察細胞自噬狀態；采用Western blot對細胞Caspase-3剪切體、LC3和P62蛋白表達量進行檢測。結果：檜木醇可以顯著抑制腎癌786-O細胞增殖，通過激活Caspase途徑誘導細胞凋亡。檜木醇誘導腎癌786-O細胞發生自噬，LC3蛋白表達顯著上調，而P62蛋白表達下調。結論：檜木醇可顯著抑制腎癌786-O細胞的增殖并通過過度激活細胞自噬促進腎癌細胞凋亡。

檜木醇腎癌凋亡增殖自噬

Correspondence to:Aili ZHANG,E-mail:z13930409899@163.com

Department of Urology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

This work was supported by the Key Research Project of Medical Science in Hebei Province(No.20110142)

腎癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤患者中，腎癌患者約占2%，每年全球新發腎癌患者超過20萬例［1］，據估計2014年全美新發腎臟腫瘤患者將會達到63 920例，而死于腎臟腫瘤的患者數量將會達到13 860例［2］。雖然傳統的外科手術治療和近年來興起的靶向治療顯著提高了腎癌患者的生存率，但腎癌作為人類主要的惡性腫瘤之一仍舊嚴重威脅著大眾健康，需進一步探索更多行之有效的治療方法。檜木醇（hinokitiol）是從柏科植物提取的一種天然化合物［3］，目前已知檜木醇具有誘導分化、抗真菌和細菌、抗炎、抗氧化等多種生物學活性［4-8］，而最近的研究發現檜木醇也具有顯著的抗腫瘤活性，并且該抗腫瘤作用與其導致DNA損傷和凋亡誘導作用有關［9-11］。本研究旨在明確檜木醇的抗腎癌作用并初步探明其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人腎癌細胞株786-O購自中國科學院細胞庫；EGFP-LC3質粒由日本大阪大學Tamotsu Yoshimori教授惠贈；檜木醇購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司；CCK-8購自日本東仁化學研究所；Z-VAD-FMK及3-MA購自美國Enzo公司；本研究所使用抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；Lipofectamine 2000為美國Invitrogen公司產品；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養細胞使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養箱中常規培養。

1.2.2CCK-8細胞增殖實驗細胞傳代接種于96孔板內，100 μL/孔，待細胞貼壁后依實驗所需加入不同濃度藥物，培養至相應時間后分別加入10 μL/孔CCK-8，放置于細胞培養箱內孵育，實時觀察，酶標儀450 nm比色。

1.2.3Annexin V/PI凋亡檢測給予相應藥物作用后的細胞常規消化離心，PBS洗滌后，加入500 μL結合緩沖液重懸，分別加入Annexin V和PI各5 μL，混勻后避光染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡狀態。1.2.4Western blot檢測收集細胞后裂解，蛋白定量，加入上樣緩沖液后煮樣變性，SDS-PAGE電泳分離后轉膜，一抗封閉過夜，次日二抗室溫封閉1 h，ECL化學發光，拍照存檔。

1.2.5質粒轉染及激光共聚焦顯微鏡觀察細胞傳代至激光共聚焦專用平皿內，貼壁后換成無血清無抗生素培養基，使用EGFP-LC3質粒及Lipofectamine 2000制備脂質體-質粒轉染復合物，加入細胞內，轉染6 h后換液，24 h后觀察轉染效果，將細胞分為對照組及實驗組，對照組給予DMSO，實驗組給予相應藥物，激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照存檔。

1.3統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。數據采用x±s表示，兩樣本均數間比較采用t檢驗，多樣本均數間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

圖1　檜木醇抑制腎癌786-O細胞增殖及誘導細胞凋亡Figure 1　Hinokitiol inhibition on the proliferation of 786-O cells and induction of cell apoptosis

2　結果

2.1檜木醇對腎癌786-O細胞增殖及凋亡的影響

CCK-8細胞增殖實驗結果表明，檜木醇處理腎癌786-O細胞24 h后，藥物濃度為2.5 μmol/L時，細胞增殖活力受到了明顯的抑制（P＜0.01），并且隨著給藥濃度（2.5、5.0、10.0 μmol/L）的增加，腫瘤細胞的增殖抑制率也逐漸增加（36.7%、71.8%、87.9%），見圖1A。為了更進一步研究檜木醇是否可以誘導腎癌細胞死亡，使用Annexin V/PI流式細胞術檢測細胞死亡率（圖1B），在給予2.5 μmol/L檜木醇作用腎癌786-O細胞24和48 h后，腎癌細胞死亡率明顯上升，Annexin V+/PI-細胞比率分別上升至1.01%和4.94%，Annexin V+/PI+比率分別上升至5.88%和25.4%。Caspase-3是凋亡最終的主要執行者之一，Caspase-3剪切體是Caspase-3的活性形式，其含量的高低可以直接說明細胞的凋亡情況。Western blot檢測結果表明，隨著給藥時間的延長，細胞Caspase-3剪切體蛋白的含量出現了明顯的升高（圖1C）。Z-VAD-FMK是Caspase蛋白的廣譜抑制劑，可以抑制Caspase蛋白的激活，從而抑制凋亡的發生。為了進一步說明檜木醇誘導的細胞凋亡是否和Caspase途徑有關，本研究使用了這一抑制劑進行CCK-8實驗，結果表明2.5 μmol/L檜木醇作用細胞24 h之后，Z-VAD-FMK可以顯著抑制藥物對腎癌786-O細胞的凋亡作用（P＜0.01，圖1D）。

2.2檜木醇誘導腎癌786-O細胞LC3蛋白酯化及自噬體形成

將EGFP-LC3質粒轉染腎癌786-O細胞，待其穩定表達后，給予細胞2.5 μmol/L的檜木醇進行處理，激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果顯示在給藥6 h后，細胞內的綠色熒光點數較對照組明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖2A）。使用Western blot檢測腎癌786-O細胞LC3蛋白和自噬特異性底物P62蛋白表達量的變化，結果表明隨著給藥時間的延長，LC3-II蛋白的表達量明顯上升，P62蛋白的表達量明顯下降（圖2B）。

2.3檜木醇誘導細胞凋亡與自噬的關系

為了更進一步說明檜木醇引起的細胞自噬與凋亡之間的關系，本研究使用了自噬的上游抑制劑3-MA進行實驗。CCK-8實驗結果表明（圖3A），3-MA（2 mmol/L）抑制了細胞自噬活動，24 h可以部分逆轉2.5μmol/L檜木醇的抗腫瘤作用（P＜0.01）。流式細胞術結果也提示3-MA（2 mmol/L）24 h可以部分拮抗檜木醇（2.5 μmol/L）對于腎癌細胞的死亡誘導作用（圖3B）。使用Western blot進行檢測發現在給予3-MA（2 mmol/L）之后，腎癌786-O細胞的LC3-II表達量顯著下降，3-MA能夠逆轉檜木醇導致的LC3-II表達量上升，Caspase-3剪切量表達量也呈現明顯的下降趨勢（圖3C，3D）。

圖2　2.5 μmol/L檜木醇于6 h時對腎癌786-O細胞自噬的誘導Figure 2　Hinokitiol（2.5 μmol/L，6 h）induction of autophagy in the 786-O cells

圖3　檜木醇誘導細胞自噬對細胞凋亡的作用Figure 3　Effects of hinokitiol induction on cell apoptosis via autophagy

3　討論

自噬是近年來生命科學及醫學領域研究的熱點之一。自噬是細胞最基本的生理活動，在維持細胞能量代謝和細胞內環境穩態方面有著重要的作用。自噬泡內的物質被溶酶體所含有的酸性水解酶水解成氨基酸、核酸、糖原和脂肪酸等小分子物質，重新釋放至胞質內參與物質的再循環或者為代謝供能［12］。

自噬在腫瘤中的作用異常復雜，目前仍不是十分清楚［13］。在正常生理狀態下自噬具有抑制腫瘤發生的作用，機制主要是由于自噬可以清除錯誤折疊的蛋白、細胞內產生的ROS和受損的線粒體，從而間接維持DNA的完整性和基因組的穩定性。當腫瘤形成后，自噬又促進了腫瘤細胞的存活，自噬可以提供給腫瘤細胞更多的能量，促進腫瘤細胞的生長，賦予了腫瘤細胞在低氧、低營養狀態下更強的生存優勢［14］。以自噬為靶點的腫瘤治療已經成為近年來腫瘤治療研究領域的新熱點。

自噬與凋亡之間存在著非常復雜的關系，機制仍舊不明。當自噬過程受到抑制時，細胞由于代謝嚴重障礙及合成底物嚴重不足，從而觸發細胞凋亡，而當自噬過程過度激活時，細胞內物質由于過度消耗，也可以導致細胞發生凋亡［15］。LC3蛋白是自噬檢測的標志蛋白之一，前體LC3蛋白合成之后經過加工修飾形成LC3-I型蛋白，自噬活化時LC3-I酯化形成LC3-II型蛋白，并定位于自噬泡。本研究使用了EGFP-LC3質粒，這一質粒經過轉錄后表達綠色熒光EGFP-LC3融合蛋白，通過觀察綠色熒光可以定位胞內的LC3。低自噬水平狀態下，EGFP-LC3在胞質內呈現綠色彌散分布，自噬激活時，EGFP-LC3定位于自噬泡上，呈現明顯的點狀分布。結果表明檜木醇可以顯著增加細胞內自噬泡的數量。Western blot結果發現檜木醇激活細胞自噬的時間（6 h）明顯早于凋亡的發生時間（24 h），同時P62蛋白的表達量在給藥之后也明顯下降。由于P62蛋白是自噬的特異性底物，所以推測檜木醇引起的腎癌786-O細胞凋亡很可能是由于細胞自噬過度激活，導致細胞內物質過度消耗所致。為了進一步解釋這一問題，本研究使用自噬抑制劑3-MA進行研究，當給予3-MA從上游抑制細胞自噬之后不僅能夠抑制檜木醇的自噬激活作用，還能夠部分抑制檜木醇對腫瘤細胞的殺傷作用，這一結果更加說明其作用機制與自噬密切相關。

從天然植物中分離提純抗腫瘤化合物對于腫瘤的治療具有廣闊的應用前景。檜木醇作為一種天然植物提取物，其抗腫瘤作用研究目前還不夠深入，現有的研究發現其具有抗乳腺癌、肺癌和直腸癌的作用［10，11，16］。本研究從體外水平證明了檜木醇的抗腎癌作用，并且發現其誘導腎癌細胞凋亡作用與自噬過程的過度激活有關，進一步豐富了檜木醇的抗腫瘤譜，并初步說明了其作用機制，為該藥物的未來開發和臨床應用提供了科學依據。

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（2014-08-19收稿）

（2014-12-21修回）

（編輯：張亻 刡）

倪曉辰專業方向為男性泌尿生殖系統腫瘤的轉化醫學相關研究。

E-mail：nixiaochenhb@163.com

Hinokitiol induces clear cell renal cancer 786-O cell apoptosis via autophagy induction

Xiaochen NI,Zhihong ZHAO,Yongliang MA,Zongtao REN,Bin LIU,Bo FAN,Shufei WEI,Aili ZHANG

Objective:To investigate the effects of hinokitiol on the proliferative inhibition and apoptosis induction in human clear cell renal cancer 786-O cells.Methods:CCK-8 assays were performed to analyze the effects of hinokitiol on the proliferation of 786-O cells.The apoptosis rate was determined by flow cytometry.EGFP-LC3 microscopy assays were performed to assess the autophagy flux.Cleaved Caspase-3,LC3,and P62 were detected by Western blot.Results:Hinokitiol could inhibit the proliferation of the 786-O cells and could induce cell apoptosis via Caspase pathway.Hinokitiol induced the autophagy of 786-O cells,increased LC3 expression,and downregulated P62 expression.Conclusion:Hinokitiol can inhibit the proliferation of 786-O cells and can induce cell apoptosis via autophagy induction.

hinokitiol,renal cancer,apoptosis,proliferation,autophagy

10.3969/j.issn.1000-8179.20141412

河北醫科大學第四醫院泌尿外科（石家莊市050011）

*本文課題受河北省醫學科學研究重點課題計劃（編號：20110142）資助

張愛莉z13930409899@163.com