FTY720對實驗性肝纖維化小鼠肝損傷的保護作用

張宸豪，李　瑤，陳　為，趙良中，李　妍

( 吉林醫藥學院檢驗學院病原生物學教研室，吉林 吉林 132013 )

FTY720對實驗性肝纖維化小鼠肝損傷的保護作用

張宸豪，李瑤，陳為，趙良中，李妍

( 吉林醫藥學院檢驗學院病原生物學教研室，吉林 吉林 132013 )

目的：觀察FTY720對刀豆蛋白A(Con A)所致肝纖維化小鼠的保護作用，探討其可能的作用機制。方法：采用刀豆蛋白A(Con A)建立小鼠肝纖維化動物模型，取40只BALB/C小鼠隨機分為空白對照組、模型組、FTY720低劑量(1 mg·kg-1)組和FTY720高劑量(4 mg·kg-1)組，每組10只。測定各組小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性和肝臟指數，觀察肝臟組織學病理變化。結果：FTY720低劑量組和高劑量組ALT、AST 活性明顯低于模型組(P<0.05 或P<0.01)。光學顯微鏡觀察，模型組有炎性細胞浸潤，肝細胞壞死。Masson 染色，模型組血管周圍有明顯纖維條束，肝小葉發生融合；與模型組比較，FTY720低劑量組和高劑量組損傷程度較輕，且隨FTY720劑量增加肝組織損傷程度逐漸減輕。結論：FTY720對實驗性肝纖維化小鼠的保護作用可能是通過降低ALT 和AST活性，進而減輕肝臟損傷程度而延緩纖維化進程。

FTY720；刀豆蛋白A；肝纖維化；肝損傷；動物模型

Jilin 132013，China )

肝病是我國發病率高且危害最為嚴重的疾病之一，而肝纖維化是慢性肝炎和慢性肝損傷的共同特征。肝纖維化的病因目前尚不清楚，免疫因素在其發病機制中占重要地位[1]，肝臟炎癥損傷過于激烈時為防止肝細胞大面積壞死，可使用免疫抑制劑抑制自身免疫反應。FTY720是1995年由日本學者從中藥冬蟲夏草培養液中提取并分離出的一種鞘氨醇樣抗生素——多球殼菌素(myriocin),經過結構修飾后得到的化合物命名為FTY720，商品名芬戈莫德(Fingolimod)[2-3]。2010年，FTY720被美國食品藥品管理局(FDA)批準作為多發性硬化癥(multiple sclerosis ，MS)的一線治療藥物。作為一種新型免疫抑制劑，FTY720作用機制獨特。FTY720可顯著減少外周血中活化T和B淋巴細胞，減少淋巴細胞向移植器官內浸潤[4-5]，具有抗移植排斥的免疫抑制作用 ，且不良反應較少。因此FTY720有望成為新一代免疫抑制劑而廣泛用于器官移植和自身免疫性疾病的潛在治療。目前尚未見有關FTY720對肝纖維化作用的報道。本研究采用刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)建立小鼠肝纖維化模型，探討FTY720對實驗性肝纖維化小鼠的保護作用及其作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器BALB/C小鼠，雄性，體質量18～22 g，購自長春億斯實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(吉)-2011-0004 號； Con A Ⅳ 購自美國Sigma公司，FTY720購自美國Caymen公司，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)購自南京建成生物技術有限公司，Masson三色膠原染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；3502G型自動酶標儀(北京普天公司產品)，DP27型顯微鏡數碼成像系統(日本奧林巴斯公司產品)。

1.2動物分組和處理實驗選用健康雄性BALB/C小鼠40只，適應性喂養7 d，稱體質量后隨機分為空白對照組、模型組、FTY720低劑量組和FTY720高劑量組，每組10只。模型組和FTY720低、高劑量組小鼠均以10 mg·kg-1Con A 尾靜脈注射，每周1次，連續9周；FTY720低量組和高劑量組分別于實驗前3 d隔日給予小鼠1和4 mg·kg-1FTY720；對照組和模型組小鼠以等體積PBS緩沖液灌胃，連續9周。各組動物于末次給藥24 h后，眼球放血處死，37℃生理鹽水灌流2次，4%多聚甲醛灌流1次，心臟灌流后收獲肝臟組織外固定48 h后，行組織病理學檢查。

1.3檢測指標和方法小鼠處死前眼球采血，靜置30 min后3 000 r·min-1離心10 min，分離血清按改良賴氏法測定ALT和AST活性。稱取肝臟總質量，計算肝臟指數。

1.4肝組織病理學分析取心臟灌流后小鼠肝臟右葉組織標本，4%多聚甲醛固定48 h 后，常規石蠟包埋、切片。HE染色和Masson三色染色分析小鼠肝臟損傷及纖維化程度。

2　結　果

2.1各組小鼠血清生化指標和肝臟指數造模9周后，眼球取血，分離血清，測定ALT和AST活性，與空白對照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST活性明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，FTY720低和高劑量組小鼠血清ALT和AST活性明顯降低(P<0.01)，但高于空白對照組(P<0.01)。與空白對照組比較,模型組小鼠肝臟指數明顯升高(P<0.01)；與模型組比較， FTY720低和高劑量組小鼠肝臟指數明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.2小鼠肝組織HE染色和Masson 染色HE結果:正常對照組小鼠肝臟組織肝細胞索清晰可見，呈放射狀排列，細胞形態正常，無炎性細胞浸潤；模型組小鼠肝臟組織肝細胞索排列紊亂，肝細胞腫大變形，呈氣球樣變，個別區域肝細胞壞死明顯，有炎性細胞浸潤。與模型組比較，FTY720低和高劑量組細胞腫脹減輕，肝細胞索可見，且有少許淋巴細胞浸潤。見圖1(插頁三)。Masson 染色：空白對照組小鼠無纖維組織明顯沉積，肝細胞形態正常，肝細胞索清晰可見。模型組小鼠肝臟組織血管周圍有明顯膠原纖維沉積，呈藍色，肝小葉發生融合，假小葉形成，并伴有大量脂肪空泡。FTY720低和高劑量組纖維化程度明顯減輕，纖維沉積程度減輕，無纖維間隔形成。見圖2(插頁三)。

表1各組小鼠血清ALT和 AST活性及肝臟指數

GroupDose(mg·kg-1)ALT[λB/(U·L-1)]AST[λB/(U·L-1)]HepaticindexBlankcontrol0.045.67±2.8233.16±2.420.055±0.001Model0.0244.55±12.72*173.33±9.14*0.087±0.002*FTY720 Highdose1.073.46±3.45△△52.24±2.79△△0.080±0.009△△ Lowdose4.062.12±2.12△△43.79±4.16△△0.073±0.003△

*P<0.01 compared with control group；△P<0.05 ，△△P<0.01 compared with model group.

3　討　論

肝纖維化是慢性肝病發展進程中的重要病理表現，是肝硬化的前期病理階段，是肝臟受到慢性損傷時細胞外基質(extracellular matrix，ECM)異常分泌并沉積在局部形成的可逆性創傷修復過程， 其進一步發展則會發展為不可逆轉的肝硬化，肝硬化是慢性肝病最主要的致死原因[6-8]。目前在臨床上對肝纖維化尚缺乏有效治療手段，抗肝纖維化的藥物包括拉米夫定、秋水仙堿、干擾素和肝細胞生長因子等，但均因療效差且副作用大使其臨床應用受限。如果能找到一種高效低毒的藥物，可以阻斷或逆轉纖維化的進程，將給患者帶來新的希望。因此積極探索肝纖維化發病機制，尋求有效治療藥物對降低肝硬化發病率和死亡率具有重要意義。

FTY720是傳統中藥冬蟲夏草中提取的有效成分多球殼菌素，通過結構改造而合成的一種新型的免疫抑制劑，主要與淋巴細胞表面的鞘氨醇-1-磷酸受體(S1P1)結合，可介導淋巴細胞在外周淋巴器官、血液和淋巴液的運輸[9-11]。FTY720的結構與鞘氨醇-1-磷酸(S1P)相似，可被細胞內鞘氨醇激酶2 (sphingosine kinase 2, Sphk2 )磷酸化為FTY720-P。FTY720-P與SIPR1結合后，導致鞘氨醇-1-磷酸受體1(SIPR1)被激活而內陷入細胞，細胞膜表面SIPR1減少導致其喪失對S1P的反應[12-13]。因此，FTY720可視為SIP1R的激動劑，拮抗SIP與受體結合的生物學作用，導致T和B淋巴細胞滯留在淋巴器官內，減少其在血液、淋巴液和黏膜等的分布以促進淋巴細胞歸巢，抑制淋巴細胞增殖，目前主要用于器官移植和多發性硬化癥的治療[14]。與其他免疫抑制劑環孢素A和他克莫司等相比，FTY720的不良反應以及細胞毒性比較小，停藥后淋巴細胞很快恢復到正常水平。為此，本實驗建立ConA誘導的小鼠肝纖維化模型，觀察其在肝纖維化防治中是否具有保護作用，為其成為防治肝纖維化的有效藥物提供有利依據。

良好動物模型的建立是研究防治肝纖維化的基礎，本研究采用小劑量Con A反復進行尾靜脈注射誘導肝纖維化建立動物模型是較為經典的實驗方法[15-20]。Con A是一種T細胞絲裂原，可刺激T細胞分裂并釋放多種炎性細胞因子,引起T淋巴細胞介導的免疫性肝損傷。本實驗采用的BALB/C小鼠是近交系小鼠，廣泛應用于體外實驗，對Con A反應明顯，肝纖維化小鼠成模率較高，能夠較好地反映肝纖維化階段性病理改變。本實驗采用10 mg·kg-1ConA 尾靜脈注射，每周注射1次，9周后取血及肝組織行血清酶學和病理學觀察。血清學檢測顯示：模型組 ALT 與 AST活性較空白對照組明顯升高，FTY720低和高劑量組ALT和AST活性較模型組下降明顯，FTY720高劑量組降低更為顯著，但高于空白對照組，說明FTY720具有一定的抗肝損傷作用。HE染色結果顯示：模型組肝細胞腫漲，胞質疏松，部分細胞呈氣球樣變，肝細胞索紊亂，炎癥細胞浸潤；FTY720組肝細胞形態大體正常，肝細胞索可見，略有紊亂，個別肝細胞腫漲及疏松，提示FTY720可減輕肝損傷程度。Masson 染色結果顯示：模型組血管周圍有明顯纖維條束，肝小葉發生融合，假小葉形成。高劑量組纖維化程度明顯減輕，纖維組織沉積減小。本實驗結果表明：FTY720可明顯阻斷Con A誘導肝纖維化小鼠損傷程度，修復炎癥損傷，有較明顯的抗肝纖維化作用，可能與其減少血液中淋巴細胞的數量和抑制炎性細胞的浸潤等有關，但其具體抗肝纖維化的作用機制尚需在以后的實驗中加以闡明。

[1]孫穎，滕光菊，常彬霞，等.自身免疫性肝炎采用免疫抑制劑治療的療效預測[J].肝臟,2012，17(11)：803-807.

[2]Di Nuzzo L，Orlando R，Nasca C，et al. Molecular pharmacodynamics of new oral drugs used in the treatment of multiple sclerosis [J]. Drug Des Devel Ther，2014,8:555-568.

[3]周琬琦，張海婧，金晶，等. S1P1受體激動劑FTY720的免疫抑制作用[J].藥學學報，2012，47(4) ：546-550.

[4]張雷，朱彤，孫爾維，等.FTY720作用機制及誘導移植免疫耐受的研究[J].中華外科雜志，2003，41(10)：773-777.

[5]Boldison J ，Chu CJ，Copland DA，et al.Tissue-resident exhausted effector memory CD8+T cells accumulate in the retina during chronic experimental autoimmune uveoretinitis[J]. J Immunol，2014,192(10)：4541-4550.

[6]姜慧卿，張曉嵐.肝纖維化的發生機制[J]. 世界華人消化雜志,2000，8(6)：687-689.

[7]紀輝，遲寶榮，張一寧.肝纖維化與肝星狀細胞[J]. 吉林大學學報：醫學版，2008，34(3)：539-541.

[8]高潤平，齊曉艷.肝纖維化的發生機制與治療進展[J]. 世界華人消化雜志，2006，14(23)：2263-2269.

[9]Matsuda S，Minowa A，Suzuki S，et al. Differential activation of c-Jun NH2-terminal kinase and p38 pathways during FTY720-induced apoptosis of T lymphocytes that is suppressed by the extracellular signal-regulated kinase pathway[J].J Immunol,1999,162(6)：3321-3326.

[10]Guo R，Ma H， Gao F，et al. Metallothionein alleviates oxidative stress-induced endoplasmic reticulum stress and myocardial dysfunction [J].J Mol Cell Cardiol，2009，47(2) ：228-237.

[11]Ishitsuka A，Fujine E，Mizutani，et al.YFTY720 and cisplatin synergistically induce the death of cisplatin-resistant melanoma cells through the downregulation of the PI3K pathway and the decrease in epidermal growth factor receptor expression[J].Int J Mol Med，2014，34(4) ：1169-1174.

[12]Jiang J， Huang X， Wang Y，et al. FTY720 induces cell cycle arrest and apoptosis of rat glomerular mesangial cells [J]. Mol Biol Rep， 2012，39(8) ：8243-8250.

[13]Essis SA，Laurier-Laurin ME，Pépin é，et al. GluN2B-containing NMDA receptors are upregulated in plasma membranes by the sphingosine-1-phosphate analog FTY720P[J].Brain Res，2015，doi: 10.1016/j.brainres.2015.07.055. [Epub ahead of print].

[14]Endo H，Chihara N，Sekiguchi MDK. A case of multiple sclerosis who relapsed early after fingolimod therapy introduced [J]. Rinsho Shinkeigaku， 2015，55(6) ：417-420.

[15]郭若涵，白彬.大型動物實驗性肝纖維化及肝纖維化模型的研究進展[J]. 世界華人消化雜志,2013，21(5)：421-426.

[16]李政通，李俊，黃成，等. CCI4誘導的大鼠肝纖維化模型肝纖維化逆轉與MAPK信號通路的研究[J].中國藥理學通報，2011，27(6)：809-814.

[17]王曉艷，萬曉龍，郭曉燕，等.阿羅洛爾、普奈洛爾和卡維地洛對肝硬化大鼠門脈高壓癥的療效比較[J].西安交通大學學報：醫學版，2015，36(16)：730-734.

[18]王林，李波，耿智敏，等.索拉菲尼對肝星狀細胞活性及活化的影響[J].鄭州大學學報：醫學版，2014，49(4)：501-504.

[19]李彬彬，明健，陳大貴，等.microRNA在肝纖維化進程中的作用[J].臨床肝膽病雜志，2013，29(5)：385-388.

[20]陸倫根，李鄭紅.肝纖維化及肝硬化研究近況[J].臨床肝膽病雜志，2013，29(5)：321-323.

Protective effect of FTY720 on hepatic injury in experimental hepatic fibrosis mice

ZHANG Chenhao， LI Yao，CHEN Wei， ZHAO Liangzhong，LI Yan

(Department of Pathogeny and Microbiology，School of Medical Laboratory，Jilin Medical University，

ObjectiveTo observe the protective effects of FTY720 on the Con A-induced mouse hepatic fibrosis injury, and to find the possible mechanisms of protective effects.MethodsThe pathologic models of hepatic fibrosis injury in the mice caused by Con A were set up.Forty mice were randomly divided into control group, model group, high dose of FTY720(4 mg·kg-1) group and low dose of FTY720 (1 mg·kg-1) dose group (n=10). The serum alanine aminotransferase(ALT) and asparate aminotransferase (AST) activities, hepatic index and pathological changes of hepatic tissue were detected .Results Compared with model group, the serum ALT and AST activities in low and high doses of FTY720 groups were decreased significantly (P< 0.05 orP< 0.01). The optical microscope results showed that there were inflammatory cells and hepatocellular necrosis in model group. The masson staining results showed that there were surrounding fiber bundle and hepatic lobule fusion in model group; compared with model group, the damage degree in low and high doses of FTY720 groups was reduced. The protective effects of FTY720 on hepatic injury showed linear relation to the drug dose.Conclusion FTY720 could decrease the levels of ALT/AST, thus FTY720 alleviate hepatic damage degree and delay the process of hepatic fibrosis.The protective effects of FTY720 on hepatic injury in experimental hepatic fibrosis mice may be related to the mechanisms mentioned above.

FTY720；concanavalin A；hepatic fibrosis；hepatic injury；animal model

1671-587Ⅹ(2015)06-1154-04

10.13481/j.1671-587x.20150611

2015-07-19

國家自然科學基金資助課題(82102953)；吉林省科技廳中青年科技創新領軍人才及團隊資助課題(20130521018JH)；吉林省科技廳重點科技攻關項目資助課題(20140203012YY)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目資助課題(2012第487號)；吉林省衛生廳重點專科項目資助課題(2013Z091)

張宸豪(1972-)，男，吉林省吉林市人，副教授，醫學博士，主要從事抗感染及免疫方面的研究 。

李妍，教授，碩士研究生導師(Tel:0431-64500461,E-mail: liyan@jlmpc.cn)

R392.12；R-332

A